مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0371S، فوسفاتاز الروبيان القلوي (rSAP)

إنزيم الفوسفاتاز القلوي المستخلص من الروبيان (rSAP) هو إنزيم فوسفاتاز قلوي حساس للحرارة، مُنقّى من مصدر مُعاد التركيب. التصنيفات ذات الصلة : الفوسفاتازات. التطبيقات: إزالة الفوسفات، استنساخ الحمض النووي الريبي. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُحلل 1 ميكرومول من فوسفات بارا-نيتروفينيل، PNPP (NEB #P0757) في حجم تفاعل إجمالي قدره 1 مل في دقيقة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار من أسيتات التريس، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 25 ملي مولار من Tris-HCl، 1 ملي مولار من MgCl2، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الوزن الجزيئي النظري: 54 كيلو دالتون. شروط قياس الوحدة : 1 مولار من ثنائي إيثانول أمين-HCl (الأس الهيدروجيني 9.8)، 0.5 ملي مولار من MgCl2، 50 ملي مولار من فوسفات بارا-نيتروفينيل. تُستخدم هذه الشروط فقط لتحديد كمية نشاط الإنزيم. الأسئلة الشائعة : س: أي من الفوسفاتاز القلوي، Quick CIP أم rSAP أم فوسفاتاز القطب الجنوبي، هو الأفضل؟ ج: يُعد Quick CIP (NEB #M0525) الخيار الأمثل لأنه يوفر بروتوكولًا سريعًا، ولا يتطلب أي إضافات، ويتميز بنشاط نوعي عالٍ. يُفضل Quick CIP على فوسفاتاز القطب الجنوبي لأنه لا يتطلب إضافة الزنك أو أي عوامل مساعدة أخرى في محلول التفاعل. ونتيجة لذلك، يمكن إضافة Quick CIP مباشرةً إلى نواتج هضم إنزيمات التقييد. بالإضافة إلى ذلك، بعد تعطيل هذا الإنزيم بالحرارة، لا داعي لتنقية الحمض النووي الناقل قبل تفاعل الربط. س: يبدو عدد المستعمرات التي لا تحتوي على قطعة مُدرجة مرتفعًا. كيف يمكنني التأكد من نجاح rSAP؟ ج: rSAP إنزيم قوي جدًا، ومن النادر ألا تكتمل عملية إزالة الفسفرة. يمكن استخدام ضوابط التحويل التالية لتشخيص هذه المشكلة: ناقل غير مقطوع: للتحقق من كفاءة الخلية ومقاومتها للمضادات الحيوية. تم قطع المتجه دون ربطه: للتحقق من وجود متجه غير مقطوع. قد يلزم تنقية المتجه باستخدام الجل (نوصي باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي من جل مونارك، NEB# T1020) لإزالة آخر 0.1% من المتجه غير المقطوع. تم قطع المتجه وربطه: للتحقق من سلامة النهايات وظروف الربط. تم قطع المتجه وإزالة الفوسفات منه وربطه: للتحقق من إزالة الفوسفات. يجب أن يكون إجمالي عدد المستعمرات أقل من 5% من المتجه المقطوع والمربوط. س: ما هي مجموعات الفوسفات التي تتم إزالتها بواسطة rSAP أو Quick CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (AnP)؟ ج: تقوم إنزيمات rSAP وQuick CIP وAnP، كما هو الحال مع أي فوسفاتاز قلوي، بإزالة الفوسفات من نهايتي 5' و3' للحمض النووي DNA وRNA أحادي السلسلة وثنائي السلسلة، كما تقوم بإزالة الفوسفات من dNTPs. لا تُؤثر الفوسفاتازات القلوية (بما في ذلك rSAP وQuick CIP وAnP) على بنية غطاء 5' للحمض النووي الريبي. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد المعالجة بـ rSAP؟ ج: لا، طالما تم تعطيل rSAP حراريًا عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل الربط. مع ذلك، إذا تم إجراء تفاعل إزالة الفسفرة مباشرةً بعد هضم الحمض النووي للناقل، فيجب تعطيل كل من إنزيم التقييد وrSAP حراريًا. في هذه الحالة، يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة لتعطيل إنزيم التقييد. س: ما مدى استقرار rSAP في محلول التخزين الخاص به عند درجات حرارة مختلفة؟ ج: يتمتع rSAP المُعاد تركيبه باستقرار مُحسّن بشكل ملحوظ مقارنةً بـ SAP الطبيعي. درجة الحرارة: -20 درجة مئوية، 25 درجة مئوية، 100% نشاط، أكثر من سنتين، أكثر من شهرين. س: ما تأثير عوامل استخلاب المعادن والفوسفات غير العضوي ونظائر الفوسفات على نشاط rSAP؟ ج: تعمل عوامل استخلاب المعادن والفوسفات غير العضوي ونظائر الفوسفات كمثبطات. س: ما تأثير عوامل الاختزال على نشاط rSAP؟ ج: قد تُقلل عوامل الاختزال، مثل DTT أو β-ميركابتوإيثانول (β-ME)، من نشاط rSAP: تركيز عوامل الاختزال والنشاط: DTT: 0 مليمولار 100%، 1 مليمولار 88%، 5 مليمولار 63%، 10 مليمولار 46%، 50 مليمولار 20%. β-ME: 0 مليمولار 100%، 5 مليمولار 95%، 10 مليمولار 78%، 20 مليمولار 75%. تم قياس نشاط rSAP باستخدام اختبار PNPP في محلول تفاعل rSAP بتركيز 1X مُضاف إليه كميات متفاوتة من DTT أو β-ME. يُعرض النشاط كنسبة مئوية مقارنةً بالعينة الضابطة التي لم تحتوي على عوامل اختزال مُضافة. س: هل يمكن استخدام Quick CIP أو rSAP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (AnP) لإزالة الفوسفات من البروتينات؟ ج: يمكن استخدام Quick CIP أو rSAP أو AnP لإزالة الفوسفات من البروتينات، ولكن توصي شركة NEB باستخدام فوسفاتاز بروتين لامدا (Lambda PP، رقم المنتج في كتالوج NEB: P0753)، وهو فوسفاتاز بروتين مزدوج ذو نطاق واسع جدًا من التخصص. س: هل يمكن تعطيل rSAP بالحرارة؟ ج: نعم. عطّل rSAP بالحرارة لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد عملية الهضم الإنزيمي وقبل خطوة إزالة الفوسفات؟ ج: إذا كان من الممكن تعطيل الإنزيمات المستخدمة في عملية الهضم الإنزيمي بالحرارة، فلا حاجة لخطوة تنقية. أما إذا كان من غير الممكن تعطيل الإنزيمات المستخدمة بالحرارة، فيُوصى بخطوة تنظيف بين عملية الهضم الإنزيمي وخطوة إزالة الفوسفات. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد خطوة إزالة الفوسفات وقبل خطوة الربط؟ ج: إذا استخدمتَ مجموعة إزالة الفوسفات السريعة (NEB #M0508)، أو rSAP (NEB #M0371)، أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (NEB #M0289)، والتي يمكن تعطيلها بالحرارة، فلا داعي لخطوة التنقية. أما إذا كان الفوسفاتاز القلوي المستخدم هو CIP، والذي لا يمكن تعطيله بالحرارة، فعندئذٍ يلزم إجراء خطوة تنقية (باستخدام مجموعة Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit NEB #T1030). س: هل الفوسفاتازات القلوية نشطة في محاليل NEBuffers؟ ج: إنزيم Quick CIP (NEB #M0525) وإنزيم rSAP (NEB #M0371) فعالان في جميع محاليل NEBuffers الخاصة بإنزيمات التقييد r1.1 و r2.1 و r3.1 ومحلول rCutSmart™ Buffer (NEB #B6004)، ويمكن إضافتهما مباشرةً إلى الحمض النووي المهضوم. يتطلب إنزيم فوسفاتاز القطب الجنوبي (NEB #M0289) وجود الزنك، ويبلغ نشاطه الأمثل عند درجة حموضة 6.0. يمكن استخدام إنزيم فوسفاتاز القطب الجنوبي في محاليل NEBuffers 1 و 2 و 3 و 4، بالإضافة إلى محاليل NEBuffers الخاصة بإنزيمي EcoRI و BamHI، فقط عند إضافة محلول تفاعل فوسفاتاز القطب الجنوبي بتركيز 10X ليصل التركيز النهائي إلى 1X. س: مشكلة في الاستنساخ: وجود تشويش كبير في خطوة التحويل. ج: في حال وجود تشويش زائد في خطوة التحويل، من المهم تحديد ما إذا كان ذلك ناتجًا عن عدم كفاءة إزالة الفوسفات أو عن وجود بلازميد غير مهضوم متبقٍ من عملية الهضم الإنزيمي. لتحديد مصدر التشويش، يجب إضافة عينتين ضابطتين في خطوة التحويل: ناقل بدون ليغاز، وناقل منزوع الفوسفات مع ليغاز. إذا كان عدد المتحولات في العينة الأولى كبيرًا، فهذا يدل على وجود بلازميد غير مقطوع في الحمض النووي للناقل. أما إذا كان عدد المتحولات في العينة الأولى منخفضًا جدًا، بينما كان عددها في العينة الثانية مرتفعًا، فهذا يدل على عدم كفاءة إزالة الفوسفات. إذا تبين أن خطوة إزالة الفوسفات هي المشكلة، فتأكد من إضافة الكمية الموصى بها من الفوسفاتاز لكل كمية موصى بها من الركيزة. كذلك، تأكد من حضانة العينة للمدة ودرجة الحرارة الموصى بهما. نوصي بتعطيل إنزيمات القطع بالحرارة قبل خطوة إزالة الفوسفات، إذا كان من الممكن تعطيلها بالحرارة. كما نوصي بتعطيل الفوسفاتاز بالحرارة قبل خطوة الربط. إذا تعذر تعطيل الفوسفاتاز بالحرارة، فنوصي بتنظيف الحمض النووي باستخدام عمود الفصل قبل خطوة الربط. يمكن تحقيق ذلك باستخدام مجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup (5 ميكروغرام) (NEB #T1030). س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.