مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0372L، UDG غير مستقر حرارياً في القطب الجنوبي

الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية الخاصة بالبنية. التطبيقات: التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإطلاق 60 بيكومول في الدقيقة من قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة من الحمض النووي مكون من 47 قاعدة يوراسيلية واحدة موسومة بالفلورسنت في 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في محلول Thermopol II Buffer 1X. شروط التفاعل: عبوة واحدة من محلول التفاعل القياسي Taq، حضانة عند 37 درجة مئوية. عبوة واحدة من محلول التفاعل القياسي Taq: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1.5 ملي مولار MgCl2 (الأس الهيدروجيني 8.3 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما هو نشاط UDG في محاليل NEBuffers من 1 إلى 4؟ ج: نشاط المحاليل المنظمة (%) محلول تفاعل Taq القياسي 100 محلول تفاعل Taq القرمزي 100 محلول تفاعل Taq LongAmp™ 100 محلول تفاعل OneTaq القياسي 100 محلول التضخيم متساوي الحرارة 100 محلول تفاعل Thermopol 100 محلول تفاعل Taq ذو التشغيل الساخن Epimark® 100 محلول تفاعل E. coli UDG 100 محلول تفاعل Pfu Turbo® Cx I10x 100 محلول تفاعل Q5 100 محلول Phusion™ HF 10 محلول تفاعل GoTaq® الأخضر 5x 100 محلول NEBuffer 1 25 محلول NEBuffer 2 50 محلول NEBuffer 3 50 محلول NEBuffer 4 100 س: هل يعمل UDG في محلول T4 DNA ligase؟ ج: نعم. سيعمل UDG بشكل جيد في محلول T4 DNA ligase. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم UDG غير المستقر حراريًا؟ ج: الوزن الجزيئي لإنزيم UDG هو 24.6 كيلو دالتون. س: هل إنزيم UDG بروتين مُوسَم؟ ج: لا، إنزيم UDG ليس بروتينًا مُوسَمًا. س: أرى أن إنزيم UDG غير المستقر حراريًا في القطب الجنوبي يعمل عند درجة حرارة 25-37 درجة مئوية. هل لديكم إنزيم جليكوزيلاز آخر يعمل عند درجات حرارة أعلى؟ ج: نعم. إنزيم Afu UDG (NEB# M0279) قادر على تحرير اليوراسيل من الحمض النووي DNA المحتوي على اليوراسيل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية. س: هل يُحرر إنزيم UDG اليوراسيل من الحمض النووي DNA أحادي السلسلة (ssDNA) وثنائي السلسلة (dsDNA)؟ ج: نعم، إنزيم UDG قادر على إزالة اليوراسيل من كليهما. س: هل يقطع إنزيم UDG الحمض النووي RNA؟ ج: لا، لا يُفترض أن يعمل إنزيم UDG على ركيزة من الحمض النووي RNA. تطورت إنزيمات UDG لإصلاح بقايا dU في الحمض النووي DNA التي يمكن أن تتكون نتيجة إزالة الأمين من dC (وبالتالي تجنب طفرة زوج القاعدة C:G إلى T:A التي تحدث عند تضاعف سلسلة اليوراسيل). س: هل يمكن استخدام UDG لإزالة dU من أوليغونوكليوتيد قصير مكون من 21 قاعدة؟ هل يجب أن تكون المسافة بين بقايا dU محددة لتجنب مشاكل القطع؟ ج: من المفترض أن تعمل إنزيمات UDG بشكل جيد على أوليغونوكليوتيد مكون من 21 قاعدة. المسافة بين القواعد ليست مهمة. س: هل هناك أي توصيات محددة لاستخدام إنزيمات UDG على الحمض النووي أحادي السلسلة؟ يبدو أن المواد الموجودة على الإنترنت وبطاقة البيانات تصف شروط الاستخدام مع الحمض النووي ثنائي السلسلة. ج: تعمل إنزيمات UDG بكفاءة متساوية في الحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة، لذا فإن توصيات الاستخدام هي نفسها لكلا النوعين من الركائز. س: هل ستقوم إنزيمات UDG الحساسة للحرارة في القطب الجنوبي بقطع الحمض النووي المحتوي على اليوراسيل في شكل ثنائي RNA-DNA؟ ج: نعم. س: ما الفرق بين UDG وUNG؟ ج: كلا الاسمين يشيران إلى إنزيم يوراسيل-دي إن إيه جليكوزيلاز. س: ما مقدار إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي الذي يجب إضافته إلى تفاعل PCR لمنع التلوث العابر؟ ج: عادةً، نضيف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي إلى 25 ميكرولتر من تفاعل PCR. س: كيف أستخدم إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لمنع التلوث العابر في تفاعلات LAMP؟ ج: يتطلب منع التلوث العابر جزأين: دمج dUTP بواسطة بوليميراز الحمض النووي أثناء تكوين الأمبليكون، واستئصال اليوراسيل من المنتجات المضخمة وتدمير الأمبليكون بواسطة إنزيم UDG. في تفاعلات LAMP، يُنصح بإجراء التفاعلات مع إضافة حوالي 50% من dUTP ممزوجًا بـ dTTP (مثل 1.4 ملي مولار من dATP، dCTP، dGTP، و0.7 ملي مولار من dTTP وdUTP)، ويُفضل استخدام بوليميراز DNA من نوع Bst لضمان دمج dU بكفاءة دون تثبيط ملحوظ للتفاعل. وللتخلص من النواتج الملوثة، يُوصى بشدة باستخدام إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي بدلاً من إنزيم UDG الأكثر استقرارًا حراريًا من الإشريكية القولونية. أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP، ثم قم بإعداد وتشغيل تفاعلات LAMP كالمعتاد. سيعمل نشاط إنزيم UDG أثناء الإعداد والتسخين إلى 65 درجة مئوية على تدمير أي نواتج ملوثة بسرعة وكفاءة. في حال الحاجة إلى تطهير أكثر دقة، يُمكن إضافة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في بداية خطوات العمل. لتبسيط الأمر، تم تضمين dUTP و UDG في مجموعة محدثة: WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix مع UDG ومجموعة الفلورسنت LAMP مجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG).