نيو إنجلاند بيولابس، M0373S، T4 RNA Ligase 2، KQ المبتور

إنزيم T4 RNA Ligase 2، وهو إنزيم KQ مُختزل، يربط الطرف 5' المُسبق الأدينيل من الحمض النووي DNA أو RNA بالطرف 3' من RNA. التصنيفات ذات الصلة: ربط RNA، تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، تخليق cDNA وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات: استنساخ RNA، تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) وتخليق cDNA، مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تعريف الوحدة: 200 وحدة هي كمية الإنزيم اللازمة لتحقيق ربط بنسبة 80% لـ RNA مكون من 31 نيوكليوتيدًا بالطرف المُسبق الأدينيل من DNA مكون من 17 نيوكليوتيدًا [رابط استنساخ miRNA العالمي (NEB #S1315)] في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولترًا خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. 5´-FAM- rArGrUrCrGrUrArGrCrCrUrUrUrArUrCrCrGrArGrArUrUrCrArGrCrArArArUrA-3´ 5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´ شروط التفاعل: محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، يُحضن عند 25 درجة مئوية. محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 مل Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الوزن الجزيئي النظري: 71378.96 دالتون، النشاط النوعي 200,000 وحدة/ملغ، شروط اختبار الوحدة: محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X مُضاف إليه 10% (وزن/حجم) من بولي إيثيلين جلايكول بوزن جزيئي 8000، و20 بيكومول من الحمض النووي الريبي الموسوم بـ 5´-FAM، و40 بيكومول من رابط الحمض النووي المُسبق الأدينيل. بعد التحضين عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، يتم الكشف عن الناتج المربوط على هلام بولي أكريلاميد مُشوه بنسبة 15%. الأسئلة الشائعة : س: هل يختلف T4 RNA Ligase 2، المُختصر KQ، عن T4 RNA Ligase 2، المُختصر K227Q؟ ج: نعم. يجمع إنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر KQ، بين طفرتين في الموقع النشط - R55K وK227Q - مما يُحسّن أداء هذا الإنزيم مقارنةً بإنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر، وإنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر K227Q. يُقلل الربط باستخدام إنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر KQ، من مستويات نواتج الربط الجانبية إلى مستويات تُضاهي تلك الخاصة بإنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر K227Q، بينما يُراكم نواتج الربط المطلوبة بمعدلات مماثلة لإنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر. س: هل توجد اختلافات في كفاءة الربط بين إنزيمات T4 RNA Ligase 2، المُختصر KQ، وT4 RNA Ligase 2، المُختصر 227Q، وT4 RNA Ligase 2، المُختصر KQ؟ ج: في اختبارات NEB، أظهرت عمليات الربط باستخدام T4 RNA Ligase 2، وT4 RNA Ligase 2 المختصر، وT4 RNA Ligase 2 المختصر K227Q، وT4 RNA Ligase 2 المختصر KQ على ركائز متطابقة أن كفاءة الربط تصل إلى نفس نقاط النهاية. في حين أن T4 Ligase 2 المختصر KQ وT4 RNA Ligase 2 المختصر يتطلبان أوقات حضانة متشابهة، إلا أن T4 RNA Ligase 2 المختصر K227Q قد يتطلب أوقات حضانة أطول للوصول إلى نقطة نهاية التفاعل. س: ما الذي يمكن لـ T4 RNA Ligase 2 المختصر KQ ربطه؟ ج: يمكن لـ T4 RNA Ligase 2 المختصر K227Q إجراء نفس عمليات الربط التي يقوم بها T4 RNA Ligase 2 المختصر (NEB #M0242). س: هل يحفز PEG كفاءة الربط؟ ج: يحفز PEG 8000 نشاط ربط T4 Rnl2tr K227Q بشكل كبير. وقد لوحظ أقصى تحفيز عند تركيز 15% (وزن/حجم) من PEG 8000. كما أن PEG 4000 محفز أيضًا، وله تأثير تركيز مشابه لتأثير PEG 8000. س: كيف يمكنني زيادة كفاءة الربط؟ ج: بشكل عام، تؤدي زيادة وقت التفاعل، وخفض درجة حرارة التفاعل، وزيادة كثافة الجزيئات إلى تفاعلات ربط أكثر اكتمالًا. يمكن زيادة أوقات التفاعل إلى 24 ساعة أو أكثر. بالنسبة لعمليات الربط التي تستغرق أكثر من ساعتين، نقوم عادةً بالحضانة عند درجة حرارة أقل من 16 درجة مئوية. وقد أفاد بعض العلماء بإجراء الربط على الجليد (0 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة. نوصي باستخدام PEG 4000 أو 8000 بتركيز يصل إلى 15% (وزن/حجم). لم تؤدِ زيادة تركيزات PEG إلى زيادة كفاءة الربط. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر KQ، في محاليل NEBuffer الأخرى؟ ج: يُلاحظ النشاط الأمثل في محلوله الخاص، ومع ذلك، يكون الإنزيم نشطًا في محلولي NEBuffer 1 و2. س: الوزن الجزيئي لإنزيم T4 RNA Ligase 2، المُختصر KQ، هو 71.6 كيلو دالتون. هل هو إنزيم مُدمج؟ ج: نعم. في اختباراتنا، أظهر الإنزيم المُدمج مع MBP والإنزيمات غير المُوسومة أداءً مُتماثلًا. س: هل PEG 8000 مُتاح للشراء؟ ج: PEG 8000 مُضمن كمُكون في محلول تفاعل T4 RNA Ligase (NEB #B0216). س: ما مدى تحمل هذا الإنزيم للملح؟ أ: NEB # RNA Ligase Salt Tolevance M0204 T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) ≤ 50 mM M0239 T4 RNA Ligase 2 (dsRNA Ligase) ≤ 50 mM M0242 T4 RNA Ligase 2, truncated ≤ 100 mM M0351 T4 RNA Ligase 2, trunc. K277Q ≤ 100 mM M0373 T4 RNA Ligase 2, trunc. KQ ≤ 100 mM M0375 SplintR Ligase ≤ 50 mM E2610 5' Adenylation Kit (Mth Ligase) ≤ 300 mM M0319 Thermostable 5' App DNA/RNA Ligase ≤ 50 mM