نيو إنجلاند بيولابس، M0374S، بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0®

هل تحتاج إلى مساعدة في تصميم بادئات LAMP؟ استخدم الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، تضخيم الجينوم الكامل، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، مواصفات التضخيم متساوي الحرارة، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 25 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. شروط التفاعل: عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة II، حضانة عند 65 درجة مئوية. عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة II: 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 150 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Tween® 20 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محلول التخزين NEBuffers : 100 ملي مولار KCl، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 0.1% Triton® X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. شروط فحص الوحدة: 50 ملي مولار KCl، 20 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.8)، 10 ملي مولار MgCl2، 30 نانومولار M13mp18 حمض نووي أحادي السلسلة، 70 نانومول من بادئ تسلسل M13 (–47) 24 قاعدة، 200 ميكرومول من dATP، 200 ميكرومول من dCTP، 200 ميكرومول من dGTP، 100 ميكرومول من dTTP بما في ذلك [3H]-dTTP و100 ميكروغرام/مل من BSA. الأسئلة الشائعة : س: هل يتم تزويد بوليميرازات الحمض النووي NEB بالنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)؟ ج: لا، يجب طلب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بشكل منفصل. يمكن طلبها كمزيج جاهز (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0447) بتركيز 10 ملي مول من كل ديوكسي نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب فردية (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0446) بتركيز 100 ملي مول من كل ديوكسي نيوكليوتيد). س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 في محاليل NEB الأخرى؟ ج: يُلاحظ النشاط الأمثل في محلول التضخيم متساوي الحرارة II، ويُلاحظ أداء شبه مثالي في محلول التضخيم متساوي الحرارة. بالنسبة للمحاليل الأخرى، نوصي بدرجة حموضة تتراوح بين 7.5 و10، وملح أحادي التكافؤ بتركيز 50-250 ملي مولار. النشاط في محاليل NEB الأخرى: NEBuffer1.1: 10%، NEBuffer2.1: 100%، NEBuffer3.1: 100%، CutSmart Buffer: 100%، ThermoPol: 75%، محلول التضخيم متساوي الحرارة: 90%. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 لإزالة النهايات غير المتداخلة؟ ج: يمكن ملء النهايات 5' المتدلية (النهايات 3' المتراجعة)، ولكن لن تتم إزالة النهايات 3' المتدلية لأن الإنزيم يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز. إن بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210)، وبوليميراز الحمض النووي T4 (NEB# M0203)، ومجموعة Quick Blunting™ (NEB #E1201) هي الخيارات الأمثل لإنتاج منتجات الحمض النووي ذات النهايات غير المتداخلة. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 لملء النهايات المتدلية 3'؟ ج: لا، لا يمكن لبوليميرازات الحمض النووي ملء النهايات المتدلية 3'. لإنتاج نهايات غير متداخلة، يجب إزالة النهايات المتدلية 3'. إن بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210)، وبوليميراز الحمض النووي T4 (NEB# M0203)، ونوكلياز فول المونج (NEB# M0250) هي الخيارات الأمثل لإزالة النهايات المتدلية 3'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 لإزالة النهايات المتدلية 5'؟ ج: لا، لا يمكن لبوليميرازات الحمض النووي إزالة النهايات المتدلية 5'. استخدم نوكلياز مونج بين (NEB# M0250) لإزالة النتوءات 5'. س: هل يمكن تعطيل بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 بالحرارة؟ ج: نعم، سخّنه عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 في التطبيقات التي تتطلب دورات حرارية؟ ج: لا، درجات حرارة التفاعل مرتفعة جدًا بالنسبة لاستقرار الإنزيم. س: هل يمكن لبوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 أن يبدأ من شق في الحمض النووي؟ ج: نعم، يمكنه بدء تخليق السلسلة من الشق باستخدام 3' OH كبادئ. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 في تفاعلات الوسم وتفاعلات التعبئة الجزئية؟ ج: نعم، يوصى أيضًا باستخدام جزء كلينو (3'→5' exo-) (NEB# M0212) لهذه التطبيقات. س: هل يمكن تخفيف بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0؟ ج: نعم، يمكن تخفيفه وتخزينه في محلول منظم يحتوي على 100 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم. المحلول المنظم المفضل هو 100 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و10 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.5)، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT، و0.1% من Triton X-100، و50% من الجلسرين. يمكن أيضًا استخدام المخفف B (NEB# B8002S). س: هل يتمتع بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 بنشاط النسخ العكسي؟ ج: نعم. لاستخدامه في تطبيقات النسخ العكسي، نوصي بتركيزات عالية من المغنيسيوم (4-8 ملي مولار). بالنسبة لتفاعلات RT-LAMP العامة، نوصي باستخدام إنزيم نسخ عكسي مخصص (WarmStart RTx، NEB #M0380) بالإضافة إلى بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي، ولكن عندما يكون النظام المطلوب هو نظام إنزيم واحد، فإن Bst 3.0 هو الإنزيم المفضل. س: هل يدمج بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 dUTP؟ ج: نعم. يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 مع مزيج من dUTP وdTTP أو مع استبدال dTTP بـ dUTP بالكامل. قد يؤدي استخدام dUTP بنسبة 100% إلى خفض عتبات التضخيم بنسبة 10%. س: هل يحتوي بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 على إكسونوكلياز نشط للتدقيق من 3' إلى 5'؟ ج: لا. إذا كنت بحاجة إلى بوليميراز للتدقيق، فنوصي باستخدام بوليميراز الحمض النووي I، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210) لتطبيقات درجات الحرارة المنخفضة وإزاحة السلسلة، أو بوليميراز الحمض النووي Q5 (NEB #M0491) لأعلى دقة في الإدماج وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نقدم العديد من الخيارات لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X لدعم الكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. أما مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA وRNA) (NEB #M1800) فيتضمن مؤشرًا لونيًا يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغير اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). وتتضمن الإصدارات المُحدثة من كلا المنتجين إنزيم UDG وdUTP غير المستقرين حراريًا لتقليل خطر التلوث العابر (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، يتوافق مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تتضمن جميع خلطات LAMP الرئيسية مزيجًا من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart لتضخيم سريع وفعال من كلٍ من الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. لا تتطلب كل خلطة سوى بادئات LAMP وعينات الحمض النووي DNA أو RNA المستهدفة التي يوفرها المستخدم. س: ما مدى فعالية Bst 3.0 عند درجات حرارة أخرى؟ ج: أقل من 45 درجة مئوية: 10-25%، 45-55 درجة مئوية: 75%، 55-72 درجة مئوية: 100%. يمكن استخدام Bst 3.0 حتى 75 درجة مئوية، ولكننا نوصي باستخدامه عند 65-72 درجة مئوية للحصول على أفضل أداء. س: كيف يمكنني تقليل التضخيم غير المتوافق مع القالب (NTC) في تفاعلات LAMP باستخدام Bst 3.0؟ ج: أنجح طريقة للتخلص من التضخيم غير المتوافق مع القالب في تفاعلات LAMP هي استخدام مجموعة بادئات مختلفة للمنتج المُضخّم، ونوصي بفحص 2-3 مجموعات من بادئات LAMP لأي هدف جديد. لكن إذا تم تحديد تصميم البادئ وظهر تضخيم غير متوافق مع القالب، فيمكن رفع درجة حرارة تفاعل Bst 3.0 LAMP إلى 72 درجة مئوية. هذه الدرجة الأعلى تقلل أو تقضي عمومًا على التضخيم غير المتوافق مع القالب. خيار ثالث هو تقليل تركيز المغنيسيوم في التفاعل. يُعد تركيز 8 ملي مولار من المغنيسيوم هو الأمثل لأداء تفاعل LAMP، ولكن بالنسبة لبعض الأهداف، يمكن تقليل التضخيم غير المتوافق مع القالب باستخدام تركيز 5-6 ملي مولار من المغنيسيوم. س: كيف أستخدم إنزيم UDG غير المستقر حراريًا في القطب الجنوبي لمنع التلوث المتبقي في تفاعلات LAMP؟ ج: يتطلب منع التلوث المتبقي جزأين: دمج dUTP بواسطة بوليميراز الحمض النووي أثناء تكوين الأمبليكون، واستئصال اليوراسيل من المنتجات المضخمة وتدمير الأمبليكون المحفز بواسطة إنزيم UDG. في تفاعلات LAMP، يُنصح بإجراء التفاعلات مع إضافة حوالي 50% من dUTP ممزوجًا بـ dTTP (مثل 1.4 ملي مولار من dATP، dCTP، dGTP، و0.7 ملي مولار من dTTP وdUTP)، ويُفضل استخدام بوليميراز DNA من نوع Bst لضمان دمج dU بكفاءة دون تثبيط ملحوظ للتفاعل. وللتخلص من النواتج الملوثة، يُوصى بشدة باستخدام إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي بدلاً من إنزيم UDG الأكثر استقرارًا حراريًا من الإشريكية القولونية. أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP، ثم قم بإعداد وتشغيل تفاعلات LAMP كالمعتاد. سيعمل نشاط إنزيم UDG أثناء الإعداد والتسخين إلى 65 درجة مئوية على تدمير أي نواتج ملوثة بسرعة وكفاءة. في حال الحاجة إلى تطهير أكثر دقة، يُمكن إضافة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في بداية خطوات العمل. لتبسيط الأمر، تم تضمين dUTP وUDG في مجموعة WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix المُحدَّثة مع UDG ومجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG). س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0؟ ج: يمكن أن تؤدي درجات الحرارة الأقل من 50 درجة مئوية أو الأعلى من 72 درجة مئوية إلى تقليل نشاط الإنزيم بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك، فإن عدم استخدام المحلول المنظم المناسب الذي يحتوي على 50-150 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، أو 2-15 ملي مولار من المغنيسيوم، أو درجة حموضة خارج النطاق 7.5-10، يؤدي إلى فشل التفاعل. انظر النشاط في المحاليل المنظمة الأخرى أعلاه. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ ج: تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه التقنية بوليميراز DNA مُزيحًا للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق متميزة من DNA المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر تقنية LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: إذ يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف RNA ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه لـ RNA مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، مما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. للمزيد من المعلومات وللاطلاع على منتجاتنا من تقنية LAMP، يُرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما الفرق بين بوليميراز الحمض النووي Bst، للقطع الكبيرة، وBst 2.0، وBst 3.0، وبوليميراز الحمض النووي Bst-XT؟ ج: جميع البوليميرازات الأربعة هي بوليميرازات حمض نووي متوسطة الثبات الحراري، تتميز بقدرتها على إزاحة السلسلة، مما يُمكّنها من إجراء تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة مثل LAMP. يُعد بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 نظيرًا مُصممًا حاسوبيًا لبوليميراز الحمض النووي Bst، للقطع الكبيرة. وقد صُمم لتحسين خصائصه في تفاعلات LAMP، بما في ذلك تحمل الملوحة، والثبات الحراري، ودمج dUTP. يتميز Bst 2.0 بخصوصيته العالية. أما Bst 3.0 فيُقدم بعض التحسينات على Bst 2.0، وأبرزها سرعة التضخيم. يتميز Bst 3.0 بأداء مُحسّن في تفاعلات LAMP عند درجات حرارة أعلى (تصل إلى 72 درجة مئوية)، إلا أنه لا يحتفظ بالدقة العالية التي يتميز بها Bst 2.0 لبعض الأهداف. يجمع Bst-XT بين أفضل خصائص Bst 2.0 وBst 3.0، حيث يوفر دقة Bst 2.0 العالية وسرعة تضخيم Bst 3.0. كما يتميز Bst-XT بنشاطه ضمن نطاق أوسع من درجات الحرارة، مما يُتيح إجراء تفاعلات LAMP بين 50 و70 درجة مئوية. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 سرعة التضخيم ★★★★★ ★★★ ★★★★★ الخصوصية ★★★★★ ★★★★★ ★★ إعداد درجة حرارة الغرفة؟ مُفعّل مُفعّل غير مُوصى به درجة حرارة LAMP المثلى 50-70 درجة مئوية 60-70 درجة مئوية 55-72 درجة مئوية متوفر خالي من الجلسرين نعم NEB #M9205 نعم NEB #M0402 نعم NEB #M0443 ★★★★★ = المنتج الأمثل والموصى به للتطبيق المحدد ★★ أو ★★★ = سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد ★ = قد يؤدي الغرض ولكن لا يُوصى به س: عند إذابة محلول التضخيم متساوي الحرارة II، ألاحظ وجود الكثير من الراسب الأبيض، هل هذا طبيعي؟ ج: نعم. نظرًا للتركيز العالي للأملاح (كبريتات المغنيسيوم، كلوريد البوتاسيوم) في محلول التضخيم متساوي الحرارة 10X II، يحدث ترسب عادةً أثناء دورات التجميد/الإذابة. سيعود هذا الراسب إلى المحلول بسهولة مع الخلط، ويجب خلط المحلول جيدًا قبل الاستخدام. س: متى يُفضّل استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0؟ ج: يتميز إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 3.0 بنشاط عالٍ في إزاحة السلسلة، مما يجعله خيارًا مثاليًا بين البوليميرازات المحبة للحرارة والبوليميرازات المحبة للحرارة المعتدلة. تتراوح درجة الحرارة المثلى له بين 60 و72 درجة مئوية، وهي أعلى من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي I، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210)، وأقل من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي Vent (NEB# M0254)، وهما بوليميرازان آخران لإزاحة السلسلة. يتيح هذا للباحثين نطاقًا أوسع من ظروف التفاعل لتحسين إزاحة السلسلة وربط البادئات. يُعدّ هذا مفيدًا في تصميم استراتيجيات التسلسل وتقنيات التضخيم متساوي الحرارة، ويُعتبر Bst 3.0 أسرع وأقوى إنزيم للطرق متساوية الحرارة مثل LAMP. كما يتميز بتحمله العالي للمثبطات الموجودة في العينات التشخيصية، مما يسمح بإجراء تفاعلات أكثر اتساقًا مع تقليل الحاجة إلى التنظيف. يتميز إنزيم Bst 3.0 بنشاط عالٍ للنسخ العكسي حتى 72 درجة مئوية، مما يُمكّن من إجراء تفاعلات RT-LAMP أحادية الإنزيم وتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) عبر البنى الثانوية المعقدة. س: لماذا أستخدم إنزيم Bst 3.0 DNA بوليميراز؟ ج: يُوسّع إنزيم Bst 3.0 DNA بوليميراز جميع الخصائص المُحسّنة لإنزيم Bst 2.0 DNA بوليميراز. يوفر Bst 3.0 أسرع أوقات التضخيم لأساليب التشخيص مثل LAMP، وهو أكثر مقاومة لمثبطات التضخيم، ويُعدّ الإنزيم المُوصى به للعينات غير النقية أو للكشف المباشر. عند استخدام هدف RNA، يُنصح باستخدام Bst 3.0 نظرًا لامتلاكه أعلى مستوى من نشاط النسخ العكسي وقدرته على إجراء تفاعل RT-LAMP أحادي الإنزيم.