نيو إنجلاند بيولابس، M0375S، ​​إنزيم سبلينت آر® ليغاز

الفئات ذات الصلة بـ SplintR ربط الحمض النووي الريبي، مواصفات إنزيمات ربط الحمض النووي المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500) تعريف الوحدة تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لربط (إلى 50٪ اكتمال) 2 بيكومول من ركيزة هجينة ثلاثية الأجزاء من الحمض النووي: الحمض النووي الريبي الموسومة بـ FAM في تفاعل 20 ميكرولتر عند 25 درجة مئوية في 15 دقيقة في محلول تفاعل إنزيم ربط SplintR 1X. شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم SplintR Ligase بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم SplintR Ligase بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار ATP، 10 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 300 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: ما الذي يثبط إنزيم SplintR Ligase؟ ج: يكون إنزيم SplintR Ligase نشطًا بين 4 و37 درجة مئوية. عند تجاوز هذه الدرجة، يبدأ الإنزيم بالتلف. ويتوقف نشاطه بشكل كبير بعد 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، تعمل الكاتيونات أحادية التكافؤ مثل NaCl وKCl على تثبيط الإنزيم. يجب الحفاظ على تركيز هذه المكونات أقل من 50 ملي مولار في التفاعل. نوفر الإنزيم في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 300 ملي مولار للحفاظ على فعاليته طوال فترة صلاحيته عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ولكن يلزم تخفيف الإنزيم بإضافته إلى التفاعل. يمكن تحقيق ذلك بسهولة باختيار تخفيف بمقدار 20 ضعفًا في إعداد التفاعل (على سبيل المثال، 1 ميكرولتر من الإنزيم في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر). وكما هو الحال مع معظم الإنزيمات، يجب تجنب وجود المنظفات الأيونية والمواد المسببة لتشوه البروتين، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم واليوريا وهيدروكلوريد الغوانيدين. س: هل يمكن استخدام إنزيم SplintR® DNA Ligase في طرق الكشف عن الحمض النووي الريبوزي الميكروي (microRNA) القائمة على الربط؟ ج: نعم، لقد ثبتت ملاءمة إنزيم SplintR DNA Ligase للكشف عن الحمض النووي الريبوزي الميكروي (microRNA) بواسطة تفاعل الكشف عن الليغاز المقترن بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، وللكشف باستخدام مجسات Padlock الدائرية. يتغلب إنزيم SplintR Ligase على محدودية كفاءة إنزيم T4 DNA ligase في الكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA) في المختبر أو في الموقع مباشرةً عن طريق الربط، مما يجعله أداةً فعّالةً للكشف عن الحمض النووي الريبوزي الميكروي (microRNA) وتحديد كميته. س: كيف يمكنني زيادة دقة الربط عند استخدام إنزيم SplintR DNA Ligase؟ ج: ثبت أن رفع درجة حرارة التفاعل يُحسّن من نشاط وخصوصية إنزيم SplintR DNA Ligase. كما أن الحضانة عند 37 درجة مئوية تُحسّن نتائج الكشف عن الحمض النووي الريبوزي الميكروي. وقد ثبت أيضًا أن إضافة ET SSB (NEB #M2401S) تزيد من النشاط وتقلل من الربط غير المستهدف عند ربط مجسات الحمض النووي (DNA) بالحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام إنزيم SplintR DNA Ligase. يُرجى مراجعة صفحة منتج SplintR DNA Ligase للاطلاع على المراجع. س: أرغب في استخدام إنزيم SplintR Ligase في سير العمل، ولكن دون استخدام محلول التفاعل المُرفق. هل يُمكنكم إخباري بمكونات محلول التفاعل المطلوبة؟ ج: نوصي بإجراء التفاعل باستخدام عامل منظم بتركيز 20-50 ملي مولار عند درجة حموضة تتراوح بين 7.5 و8.0. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون تركيز المغنيسيوم ≥ 5 ملي مولار لتحقيق أقصى فعالية. لا يُشترط وجود المنجنيز، ولكننا نلاحظ زيادة في الفعالية عند وجود هذا الكاتيون ثنائي التكافؤ بتركيز أعلى من 5 ملي مولار. يُعدّ الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ضروريًا، ولكن الإنزيم يكون نشطًا ضمن نطاق واسع من التركيزات (10 نانومولار - 1 ملي مولار). س: يبدو أن إنزيم SplintR Ligase مُركّز جدًا عند 25 وحدة لكل ميكرولتر. كيف أعرف الكمية التي يجب إضافتها إلى التفاعل؟ ج: تم تطوير إنزيم SplintR Ligase لمجتمع علوم الحياة، مع تقدير كبير لفائدته ككاشف للكشف. من المحتمل أن يكون من الضروري إجراء بعض التحسينات التجريبية للتطبيقات الفردية. لقد استخدمنا فحصًا عالي الحساسية، حيث يوجد الركيزة بكميات نانومولار. على هذا النحو، فإن تعريف الوحدة مُوجّه للتطبيقات التي تُستخدم فيها كميات نانوغرامية واحدة من الركيزة بشكل روتيني. يُزوَّد الإنزيم كمحلول بتركيز 10.5 ميكرومولار. نقترح الحفاظ على تركيز الإنزيم أقل من 1 ميكرومولار في التفاعل، ضمن نطاق مُقترح يتراوح بين 100 نانومولار و1 ميكرومولار. في العديد من التطبيقات، يُعد البدء بزيادة ضعف كمية الإنزيم عن عدد النهايات القابلة للربط مثاليًا. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم يكن التفاعل يسير بالكفاءة المطلوبة، نوصي بشدة بتمديد فترة الحضانة بدلًا من زيادة كمية الإنزيم في التفاعل. س: ما مدى تحمل هذا الليغاز للملح؟ ج: NEB # RNA Ligase Salt Tolerance M0204 T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) ≤ 50 mM M0239 T4 RNA Ligase 2 (dsRNA Ligase) ≤ 50 mM M0242 T4 RNA Ligase 2, truncated ≤ 100 mM M0351 T4 RNA Ligase 2, trunc. K277Q ≤ 100 ملي مولار M0373 T4 RNA Ligase 2، مُقَطَّع. KQ ≤ 100 ملي مولار M0375 SplintR Ligase ≤ 50 ملي مولار E2610 5' Adenylation Kit (Mth Ligase) ≤ 300 ملي مولار M0319 Thermostable 5' App DNA/RNA Ligase ≤ 50 ملي مولار. س: ما نوع النهايات التي يربطها SplintR Ligase؟ ج: يتميز SplintR Ligase بفعاليته العالية في سد الشقوق بين بقايا الحمض النووي المتجاورة في خيوط الحمض النووي المهجنة مع جسور أو دعامات الحمض النووي الريبي، بكفاءة تفوق في كثير من الأحيان 10-100 ضعف كفاءة T4 DNA ligase. على ركيزة DNA كاملة، يكون نشاط سد الشقوق هذا مكافئًا لنشاط إنزيمات ربط الحمض النووي الأخرى. إنه ليس خيارًا جيدًا لسير عمل الاستنساخ الجزيئي الذي يتطلب إصلاح انقطاعات السلسلة المزدوجة (مثل ربط ناقل وإدخال).