نيو إنجلاند بيولابس، M0378S، بوليميراز الحمض النووي الريبي T3

إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA) الخاص بفيروس العاثية T3 هو إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي (DNA)، وهو شديد التخصص لمُحفِّز فيروس العاثية T3. الفئات ذات الصلة : تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) وإنزيمات النسخ العكسي، تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) والنسخ في المختبر (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات لتطبيقات الحمض النووي الريبي (RNA). مواصفات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) . المواد المطلوبة (غير مُرفقة ): مُثبِّط إنزيم الريبونيوكلياز (RNase)، فأري (NEB #M0314) (اختياري)، مزيج محلول الريبونوكليوتيدات (NEB #N0466)، ثنائي ثيوثريتول (DTT) طازج (اختياري)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لدمج 1 نانومول من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مول من كل من ATP وUTP وGTP وCTP وقالب الحمض النووي الذي يحتوي على مُحفز بوليميراز الحمض النووي الريبي T3. يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي RNAPol بتركيز 1X، يحتوي على: 40 ملي مولار من Tris-HCl، 6 ملي مولار من MgCl2، 1 ملي مولار من DTT، 2 ملي مولار من السبيرميدين (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 100 ملي مولار من NaCl، 50 ملي مولار من Tris-HCl، 1 ملي مولار من EDTA، 20 ملي مولار من 2-مركابتوإيثانول، 0.1% من Triton® X-100، 50% (وزن/حجم) من الجلسرين (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). شروط فحص الوحدة : محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي RNAPol بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من كل من ATP وUTP وGTP وCTP و2 ميكروغرام من حمض T3 النووي في 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: ما هو تسلسل المحفز لبوليميراز الحمض النووي الريبي T3؟ ج: مُحفِّز T3: 5′ AATTAACCCTCACTAAAG 3′. يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 عملية النسخ عند النيوكليوتيد G المُسطَّر في تسلسل المُحفِّز. ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام الشريط المقابل كقالب من 5′ إلى 3′. ستكون القاعدة الأولى في النسخة هي G. س: هل يتطلب تفاعل النسخ باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 بادئًا؟ ج: لا، يتعرف بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 على تسلسل المُحفِّز الخاص به ويبدأ النسخ عند النيوكليوتيد G الأخير. ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام الشريط المقابل كقالب من 5′ إلى 3′. س: هل يترك بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 قاعدة إضافية في نهاية النسخة؟ ج: نعم، يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي T3 إضافة قاعدة واحدة أو بضع قواعد إضافية في نهاية النسخة، مما ينتج عنه مجموعة من النسخ ذات نهايات 3′ غير متجانسة. س: هل يعمل بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 على الحمض النووي البلازميدي غير المقطوع؟ ج: نعم، ولكن بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 هو إنزيم شديد التكرار، وسيستمر في نسخ الحمض النووي الريبي حول قالب دائري عدة مرات دون أن ينفصل. يمكن تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو امتدادًا 5' أسفل الحمض النووي المستهدف. س: هل يمكن إنتاج حمض نووي ريبي شاذ عند استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T3؟ ج: لوحظ إنتاج حمض نووي ريبي شاذ عندما ينتج عن إنزيم التقييد المستخدم لتحويل البلازميد إلى شكل خطي أسفل الحمض النووي المستهدف امتدادًا 3'. لتجنب ذلك، يجب قطع البلازميد باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو امتدادًا 5' أسفل الحمض النووي المستهدف. س: هل يمكنني استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 لصنع مجسات موسومة إشعاعيًا ذات نشاط نوعي عالٍ؟ ج: نعم، يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي 3، وبوليميراز الحمض النووي الريبي SP6، وبوليميراز الحمض النووي الريبي T7، بالإضافة إلى مجموعة HiScribe T7 (NEB #E2040) لصنع مجسات الحمض النووي الريبي. يمكن الحصول على حساسية كشف أعلى للأحماض النووية باستخدام مجس الحمض النووي الريبي نظرًا لاستقرار هجائن الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين بشكل أكبر من هجائن الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين. س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T3؟ ج: بوليميراز الحمض النووي الريبي T3 حساس للغاية لتثبيط الأملاح. يجب ألا يتجاوز تركيز الملح أحادي التكافؤ 20 ملي مولار. يجب تحضير قالب الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين خاليًا من الأملاح. يؤدي تلوث RNase إلى تحلل منتج الحمض النووي الريبي. نوصي باستخدام مثبط RNase (NEB #M0314 أو #M0307) في التفاعل بتركيز وحدة واحدة/ميكرولتر. استخدم ماءً فائق النقاء وتأكد من استخلاص قالب الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين باستخدام الفينول/الكلوروفورم. س: لماذا النشاط النوعي للمجس منخفض؟ أ: يجب أن يكون تركيز النيوكليوتيد المشع محدودًا (6 ميكرومول). بمعنى آخر، عند استخدام ATP الموسوم، أضف 500 ميكرومول من UTP وCTP وGTP، ولكن 6 ميكرومول فقط من ATP في عملية النسخ، بحيث يتم دمج ATP بنسبة أعلى، مما ينتج عنه مسبار RNA عالي الإشعاع.