مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0379S، إكسونوكلياز VII

الفئات ذات الصلة: الإكسونوكليازات والإندونيوكليازات غير المحددة. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستحفز إطلاق 1 نانومول من النيوكليوتيد القابل للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل إكسونوكلياز VII بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل إكسونوكلياز VII بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار فوسفات الصوديوم، 8 ملي مولار EDTA، 10 ملي مولار 2-مركابتوإيثانول (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50% جلسرين، 50 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 0.1 مولار كلوريد الصوديوم، 0.1% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. شروط فحص الوحدة : محلول تفاعل إكسونوكلياز VII بتركيز 1X يحتوي على 0.15 ملي مولار من الحمض النووي أحادي السلسلة [3H] E. coli المُعالج بالموجات فوق الصوتية. الأسئلة الشائعة : س: ما هو نشاط إكسونوكلياز VII في المحاليل التالية؟ ج: نشاط المحاليل المنظمة (%) محلول تفاعل Taq القياسي 100 محلول تفاعل Taq القرمزي 50 محلول تفاعل Taq LongAmp® 100 محلول تفاعل Taq القياسي OneTaq® 100 محلول التضخيم متساوي الحرارة 75 محلول تفاعل Thermopol® 75 محلول تفاعل Taq ذو البداية الساخنة Epimark® 100 محلول تفاعل Q5® 75 محلول تفاعل Q5 + مُحسِّن 60 محلول ربط الحمض النووي T4 50 محلول Phusion™ HF 90 محلول تفاعل GoTaq الأخضر 25 محلول NEBuffer 1 10 محلول NEBuffer 2 75 محلول NEBuffer 3 75 محلول NEBuffer 4 75 Cutsmart™ 75 س: هل يعمل إنزيم Exonuclease VII في محلول PCR؟ ج: نعم. يعمل إنزيم Exonuclease VII بشكل جيد في معظم محاليل PCR كما هو موضح في الجدول التالي. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم إكسونوكلياز VII؟ ج: الوحدة الفرعية الكبيرة 51.8 كيلو دالتون، والوحدة الفرعية الصغيرة 8.8 كيلو دالتون. س: هل إنزيم إكسونوكلياز VII بروتين مُوسَم؟ ج: لا، إنزيم إكسونوكلياز VII ليس بروتينًا مُوسَمًا. س: هل يقطع إنزيم إكسونوكلياز VII الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: لا، لا يُفترض أن يعمل إنزيم إكسونوكلياز VII على ركيزة من الحمض النووي الريبي. س: هل يمكن إزالة النهايات غير المتداخلة للحمض النووي (DNA) باستخدام إنزيم إكسونوكلياز VII؟ ج: لا، النهايات القصيرة التي يبلغ طولها 4 أزواج قاعدية أو أقل ليست ركائز جيدة. استخدم بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210) لملء النهايات المتدلية 5' (وتسمى أيضًا النهايات المتراجعة 3') وقم بإزالة النهايات المتدلية 3'، أو استخدم نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) لإزالة النهايات المتدلية 3' أو 5'. ملاحظة: لا يمكن ملء النتوءات 3'. س: ما الفرق بين إكسونوكلياز VII وإكسونوكلياز I (NEB# M0293)؟ ج: يستطيع إكسونوكلياز VII تحليل الحمض النووي أحادي السلسلة من كلا الاتجاهين، على عكس إكسونوكلياز I الذي يعمل فقط من 3' إلى 5'. كما يستطيع إكسونوكلياز VII تحليل كلٍ من قليل النوكليوتيدات أحادية السلسلة المُفسفرة طرفيًا 5' أو 3'. أما إكسونوكلياز I فيُثبط بوجود الفوسفوروثيوات في الطرف 3'. س: كيف تُزال البادئات من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ ج: في البروتوكول المعتاد، نخلط 5 ميكرولتر من نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل مع 2 ميكرولتر من إكسونوكلياز VII، ثم نحضّن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.