نيو إنجلاند بيولابس، M0380L، إنزيم النسخ العكسي WarmStart® RTx

هذا المنتج متوفر في الفئات ذات الصلة RT-PCR، وتخليق الحمض النووي التكميلي والنسخ العكسي، وتطبيقات تضخيم إزاحة السلسلة وإنزيم القطع، وتخليق الحمض النووي التكميلي، والنسخ العكسي (تخليق الحمض النووي التكميلي)، وتعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية باستخدام poly(rA)•oligo(dT)18 كقالب. شروط التفاعل: عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة، عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة، 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 50 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Tween® 20 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 100 ملي مولار KCl، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. شروط فحص الوحدة: 20 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.8)، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 50 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Tween-20، 0.5 ملي مولار dTTP. 0.4 ملي مول من بولي(rA)•أوليجو(dT)18. الأسئلة الشائعة : س: كان حجم المنتج مُدرجًا سابقًا بالتفاعلات، وهو مُدرج الآن بالوحدات. ما الذي تغير؟ ج: لتوحيد حجم المنتج وتوفير مرونة في الاستخدام، قمنا بتغيير حجم المنتج ليُدرج بالوحدات. سينتج عن ذلك التغييرات التالية: M0380S: تم تغيير 50 ​​تفاعلًا إلى 400 وحدة. M0380L: تم تغيير 250 تفاعلًا إلى 2000 وحدة. في كلتا الحالتين، زاد حجم المنتج المُورّد قليلًا لاستيعاب التغيير إلى الوحدات. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ ج: تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن حمض نووي مستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه التقنية بوليميراز DNA مُزيحًا للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق متميزة من DNA المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر تقنية LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: إذ يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف RNA ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه لـ RNA مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، مما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. للمزيد من المعلومات وللاطلاع على منتجاتنا من تقنية LAMP، يُرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما هي مزايا تقنية WarmStart® RTx؟ ج: على غرار استخدام بوليميرازات الحمض النووي ذات البدء الساخن، يُمكّن إنزيم النسخ العكسي ذو البدء الدافئ من الحصول على أداء ثابت في تفاعلات التضخيم. بفضل خاصية WarmStart®، يُمكن إجراء أي تفاعل RT-LAMP باستخدام WarmStart RTx أو بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart (NEB #M0538) في درجة حرارة الغرفة، دون حدوث تضخيم خارج الهدف. توفر هذه الخاصية تحكمًا أدق في الكشف عن الحمض النووي الريبي (RNA) وتفاعلات تضخيمه، وتُتيح مرونة في الإعداد عالي الإنتاجية أو بدون استخدام الثلج. س: ما مدى حساسية تضخيم الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام WarmStart® RTx؟ ج: يُمكن لتفاعلات RT-LAMP أحادية الخطوة باستخدام WarmStart RTx أن تُوفر تضخيمًا للهدف بشكل روتيني باستخدام كمية قليلة تصل إلى 1 بيكوغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) المُدخل. يمكن لتفاعلات RT-PCR باستخدام WarmStart RTx أو Hot Start Taq تضخيم الهدف بكمية ضئيلة تصل إلى 10 فيمتوغرام من الحمض النووي الريبي المدخل. س: هل يمكن تعطيل WarmStart® RTx؟ ج: نوصي بالتسخين إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. س: هل WarmStart® RTx فعال في محاليل منظمة أخرى؟ ج: نعم، WarmStart® RTx فعال بشكل عام في محاليل منظمة ذات درجة حموضة أعلى من 7.5، وتركيز ملح أحادي التكافؤ من 10 إلى 200 ملي مولار، وتركيز أيونات المغنيسيوم من 2 إلى 20 ملي مولار. النشاط في محاليل NEB المنظمة الأخرى: NEBuffer1.1: 10%، NEBuffer2.1: 75%، NEBuffer3.1: 75%، CutSmart™ Buffer: 90%، ThermoPol™: 90%. س: كيف أستخدم WarmStart® RTx في RT-LAMP؟ ج: حضّر مزيجًا بحجم 25 ميكرولتر يحتوي على: 2.5 ميكرولتر من محلول التضخيم متساوي الحرارة (1X)، 6 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم (8 ملي مولار إجمالي)، 1.4 ملي مولار من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTP)، 1.6 ميكرومولار من FIP/BIP، 0.2 ميكرومولار من F3/B3، 0.4 ميكرومولار من LoopF/B، 8 وحدات من Bst 2.0 WarmStart® أو Bst 2.0®، 7.5 وحدات من WarmStart® RTx. ضع المزيج مباشرةً عند درجة حرارة 65 مئوية. س: ما هو أقصى طول لمنتج الحمض النووي المكمل (cDNA) الناتج عن WarmStart® RTx؟ ج: طُوّر WarmStart RTx لتحقيق أفضل أداء مع القطع المضخمة القصيرة في تفاعلات التضخيم التشخيصية (مثل RT-LAMP وRT-PCR). ومع ذلك، فهو يؤدي أداءً جيدًا في تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، مع منتجات يصل طولها إلى 5 كيلوبايت. لمنتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) الأطول، نوصي باستخدام ProtoScript® II (NEB #M0368) أو مجموعة ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB #E6560). أما لمنتجات cDNA الأطول، فنوصي باستخدام إنزيم النسخ العكسي Induro® (NEB #M0681)، وهو إنزيم نسخ عكسي مشفر بواسطة إنترون المجموعة الثانية. س: كيف أستخدم WarmStart® RTx لتخليق cDNA؟ ج: حضّر مزيجًا بحجم 20 ميكرولتر يحتوي على: 2 ميكرولتر من محلول التضخيم متساوي الحرارة (1X)، 0.5 ملي مولار من dNTP، 6 ميكرومولار من مزيج البادئات العشوائية، 20 وحدة من مثبط RNase الفأري، 3.75 وحدة من مزيج WarmStart® RTx. حضّن المزيج لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية للتهجين، ثم لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية للتخليق. عطّل إنزيم النسخ العكسي RTx بتسخينه لمدة 10 دقائق عند 80 درجة مئوية. س: هل يحتوي WarmStart® RTx على نشاط RNase H؟ ج: نعم، يحتوي WarmStart® RTx على نطاق RNase H نشط. س: ما هي النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) التي توصون باستخدامها مع WarmStart® RTx؟ ج: نوفر النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بصيغتين. يمكن طلبها كمزيج جاهز (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد، (NEB #N0447)، بتركيز 10 ملي مولار لكل نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب منفصلة (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد، (NEB #N0446)، بتركيز 100 ملي مولار لكل نيوكليوتيد). س: هل يمكن استخدام الحمض النووي DNA كقالب لـ WarmStart® RTx؟ ج: نعم، ولكن التفاعل أقل كفاءة بكثير مقارنةً بتخليق الحمض النووي DNA الموجه بالحمض النووي الريبي RNA. تبلغ كفاءة تخليق الحمض النووي DNA الموجه بالحمض النووي DNA حوالي 10-20% من كفاءة تخليق الحمض النووي DNA الموجه بالحمض النووي الريبي RNA عند درجة حرارة 45 درجة مئوية، وحوالي 50% عند درجة حرارة 55 درجة مئوية. س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نوفر عدة خيارات لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X لدعم الكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. أما مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X الرئيسي (DNA وRNA) (NEB #M1800) فيتضمن مؤشرًا لونيًا يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغير اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). تتضمن الإصدارات المحدثة من كلا المنتجين UDG وdUTP حساسين للحرارة لتقليل خطر التلوث المتبقي (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، فإنّ مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) متوافق مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تحتوي جميع مزيجات LAMP الرئيسية على مزيج من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart لتضخيم سريع وقوي من كلٍّ من الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. لا يتطلب كل مزيج سوى بادئات LAMP وعينات الحمض النووي DNA أو الحمض النووي الريبي RNA المستهدفة التي يوفرها المستخدم.