نيو إنجلاند بيولابس، M0386T، نوكلياز Cas9، S. pyogenes

متوفر الآن: EnGen Spy Cas9 HF1 الفئات ذات الصلة التحقق من صحة تحرير الجينات القائم على CRISPR، مواصفات نوكليازات CRISPR/Cas المواد المطلوبة ولكن غير المضمنة sgRNA مقدم من المستخدم EnGen® sgRNA Synthesis Kit، S. Pyogenes (NEB #E3322) HiScribe® Quick T7 High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050) مورد خارجي ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500) بروتينيز K، درجة البيولوجيا الجزيئية (NEB #P8107). شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول التخزين: 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الأسئلة الشائعة: س: لماذا ألاحظ هضمًا غير مكتمل؟ ج: قد يكون الهضم غير المكتمل ناتجًا عن العوامل التالية: نسبة غير صحيحة من نوكلياز Cas9 إلى الحمض النووي الريبوزي الدليل، وموقع الهدف. للهضم الكامل، نوصي بنسبة مولية 10:10:1 أو أعلى من نوكلياز Cas9: الحمض النووي الريبوزي الدليل: موقع الهدف. تسلسل غير مثالي للحمض النووي الريبوزي الدليلي - تحقق من تسلسل وتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليلي. جودة رديئة للحمض النووي الريبوزي الدليلي - تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليلي باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي. محلول منظم غير مثالي - يرجى استخدام محلول NEBuffer 3.1 المرفق مع الإنزيم. س: لماذا تختلف كفاءة الهضم بين نوعين من الحمض النووي الريبوزي الدليلي الفرعي (sgRNA)؟ ج: قد تتأثر كفاءة الهضم بتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليلي الفرعي. تحقق من تسلسل وتصميم قالب نسخ الحمض النووي الريبوزي الدليلي الفرعي. قد تتأثر كفاءة الهضم بجودة الحمض النووي الريبوزي الدليلي الفرعي. تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليلي الفرعي باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي. س: هل توفر شركة NEB بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الدليلي؟ ج: لا نوزع بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الدليلي الفرعي، ولكننا نوصي بزيارة موقع Addgene إذا كنت ترغب في الحصول على بلازميدات الحمض النووي الريبوزي الدليلي الفرعي. يمكن استخدام قوالب الحمض النووي قليلة النوكليوتيدات التي تحتوي على مُحفِّز T7 وتُشفِّر الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) مع مجموعة HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050). نوصي باستخدام مجموعة EnGen® sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (NEB #E3322S)، التي تستخدم قليل النوكليوتيدات DNA المُصمَّمة خصيصًا للهدف من قِبَل المستخدم، وتُوفِّر طريقة سريعة لنسخ كميات كبيرة من الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) في تفاعل واحد مدته 30 دقيقة. س: هل يحتوي إنزيم Cas9 Nuclease على إشارة توطين نووي (NLS)؟ ج: لا، إنزيم Cas9 Nuclease (NEB #M0386) لا يحتوي على إشارة توطين نووي. ولكننا نُقدِّم منتجًا بديلًا، وهو EnGen® Cas9 NLS، S. pyogenes (NEB# M0646) الذي يحتوي على إشارة توطين نووي. س: هل إنزيم Cas9 Nuclease مُدمج مع علامة 6XHis في الطرف الأميني؟ ج: نعم. س: كيف أخفف الإنزيم إلى تركيز 1 ميكرومولار للتفاعلات المختبرية؟ ج: إذا كنت تخطط لاستخدام تركيز أعلى من الإنزيم لهضم الحمض النووي في المختبر، فيمكن تخفيف الإنزيم إلى تركيز 1 ميكرومولار في محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X واستخدامه فورًا. يجب عدم تجميد محلول التخفيف بتركيز 1 ميكرومولار في محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X. إذا كان سيتم تخزين المحلول المخفف بتركيز 1 ميكرومولار عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، فيجب تخفيفه باستخدام المخفف B (مع الألبومين المؤتلف) (NEB #B8533S): 300 ميكرومولار كلوريد الصوديوم، 10 ميكرومولار Tris-HCl، 0.1 ميكرومولار EDTA، 1 ميكرومولار DTT، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مؤتلف، و50% جلسرين (الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية) قبل تحضير التفاعل. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.