مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0392S، بيتا-أجاراز I

الفئات ذات الصلة الأخرى، تطبيقات استخلاص الحمض النووي من الجل، مواصفات تنقية الأحماض النووية، تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 200 ميكرولتر من الأجاروز المنصهر ذي نقطة الانصهار المنخفضة أو أجاروز NuSieve إلى نيوأجارو-أوليغوساكاريد غير قابل للترسيب في ساعة واحدة عند 42 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل β-أجاراز I بتركيز 1X، يُحضن عند 42 درجة مئوية. محلول تفاعل β-أجاراز I بتركيز 1X، 10 ملي مولار من ثنائي-تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار من EDTA (الأس الهيدروجيني 6.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار من ثنائي-تريس-هيدروكلوريد، 1 ملي مولار من EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 6.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الأسئلة الشائعة: س: هل يمكن إجراء ربط الحمض النووي ومعالجات الحمض النووي الأخرى على شرائح الجل المعالجة بـ β-أجاراز I التي تحتوي على الحمض النووي؟ ج: نعم. س: ما هو الوزن الجزيئي لـ β-أجاراز I؟ ج: 30,000 دالتون. س: ما نوع الأجاروز الذي يهضمه β-أجاراز I؟ ج: لا يُناسب هضم بيتا-أجاراز I إلا الأجاروز ذو درجة الانصهار المنخفضة، إذ يجب أن يكون المحلول سائلاً عند درجة حرارة الحضانة 42 درجة مئوية. إذا انخفضت درجة الحرارة عن 42 درجة مئوية أثناء التفاعل، حتى الأجاروز ذو درجة الانصهار المنخفضة سيبدأ بالتجمد ويصبح غير قابل للهضم. س: هل يعمل بيتا-أجاراز I في محاليل منظمة أخرى؟ ج: نعم. يعمل بيتا-أجاراز I في الماء وفي محاليل منظمة أخرى. يجب مضاعفة تركيز بيتا-أجاراز I للحصول على فعالية كاملة في المحاليل المنظمة الأخرى. يحمي الإيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) الموجود في محلول بيتا-أجاراز I الحمض النووي من مستوى منخفض من التلف الذي يُلاحظ في المحاليل المنظمة التي تحتوي على المغنيسيوم. س: لماذا يتكون راسب أبيض بعد التفاعل باستخدام بيتا-أجاراز I؟ ج: لم يكتمل التفاعل. راجع الأسئلة أدناه لتحسين التفاعل. س: هل يمكن هضم هلام ذي نسبة عالية من درجة الانصهار المنخفضة باستخدام بيتا-أجاراز I؟ ج: يعمل إنزيم بيتا-أجاراز I بكفاءة عالية على المحاليل التي تحتوي على 1% أجاروز أو أقل. وللحصول على أفضل هضم للهلامات ذات النسب الأعلى، قم بإذابة شريحة الهلام عند 65 درجة مئوية، ثم اضبط الحجم باستخدام محلول منظم بيتا-أجاراز I بتركيز 1X بحيث يكون التركيز النهائي للأجاروز 1%. س: ما هو السبب الشائع لفشل تفاعل بيتا-أجاراز I؟ ج: العمل عند درجة حرارة غير مناسبة. يتعطل إنزيم بيتا-أجاراز I بسرعة عند درجات حرارة أعلى من 45 درجة مئوية. يجب إذابة الأجاروز ذي نقطة الانصهار المنخفضة عند 65 درجة مئوية، ثم ضبط درجة حرارته عند 42 درجة مئوية. لذلك، عند العمل بأحجام كبيرة، تأكد من ترك وقت كافٍ للأجار المنصهر للوصول إلى درجة حرارة 42 درجة مئوية. عند درجات حرارة منخفضة، يبدأ الأجاروز بالتصلب، مما يجعله مقاومًا للهضم. س: هل يؤثر محلول تشغيل الهلام على تفاعل بيتا-أجاراز I؟ ج: يعمل إنزيم بيتا-أجاراز I بشكل أفضل على الهلامات المصنوعة باستخدام محلول تريس-أسيتات (TAE). أما بالنسبة للهلامات المصنوعة باستخدام محلول تريس-بورات (TBE)، فيُنصح بمضاعفة الكمية المطلوبة من إنزيم بيتا-أجاراز I. س: كيف يمكن تعطيل إنزيم بيتا-أجاراز I بالحرارة؟ ج: يؤدي الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين أو الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى تعطيل 50 وحدة من إنزيم بيتا-أجاراز I. س: ما مدى استقرار إنزيم بيتا-أجاراز I في التفاعل؟ ج: يحتفظ إنزيم بيتا-أجاراز I بنشاطه لعدة ساعات عند درجة حرارة 45-50 درجة مئوية، ويتم تثبيته بوجود الأجاروز في التفاعل. س: ما هو الرقم الهيدروجيني الأمثل لهضم بيتا-أجاراز I؟ ج: يُظهر إنزيم بيتا-أجاراز I نشاطًا مثاليًا عند الرقم الهيدروجيني 6.5. يتم الحفاظ على أكثر من 75% من النشاط الأمثل بين درجة حموضة 5.0 - 8.5.