نيو إنجلاند بيولابس، M0402L، Bst 2.0 WarmStart® DNA بوليميراز (خالي من الجلسرين)

الفئات ذات الصلة: التضخيم متساوي الحرارة وتطبيقات إزاحة السلسلة، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، التضخيم متساوي الحرارة، تضخيم الحمض النووي، مواصفات PCR و qPCR، تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 25 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الحمض في 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. محلول التخزين 10 ملي مولار Tris-HCl 50 ملي مولار KCl 1 ملي مولار DTT 0.1 ملي مولار EDTA 0.1% Triton® X-100 pH 7.1 @ 25 درجة مئوية التعطيل الحراري 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة شروط فحص الوحدة 50 ملي مولار KCl، 20 ملي مولار Tris-HCl (pH 8.8)، 10 ملي مولار MgCl2، 30 نانومولار M13mp18 SS DNA، 70 نانومولار M13 بادئ التسلسل (–47) 24 mer، 200 ميكرومولار dATP، 200 ميكرومولار dCTP، 200 ميكرومولار dGTP، 100 ميكرومولار dTTP بما في ذلك [3H]-dTTP و100 ميكروغرام/مل rAlbumin. الأسئلة الشائعة : س: هل تُزوَّد بوليميرازات الحمض النووي من NEB مع النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)؟ ج: لا، يجب طلب النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بشكل منفصل. يمكن طلبها كمزيج جاهز (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0447) بتركيز 10 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب منفصلة (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0446) بتركيز 100 ملي مولار لكل ديوكسي نيوكليوتيد). س: هل يمكن تعطيل بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® بالحرارة؟ ج: نعم، يُسخَّن عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في التطبيقات التي تتطلب دورات حرارية؟ ج: لا، درجات حرارة التفاعل مرتفعة جدًا بالنسبة لاستقرار الإنزيم. س: هل يمكن لبوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® أن يبدأ من شق في الحمض النووي؟ ج: نعم، يمكنه بدء تخليق السلسلة عند وجود قطع في الحمض النووي باستخدام مجموعة OH في الطرف 3' كبادئ. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في درجات حرارة أخرى غير 65 درجة مئوية؟ ج: نعم، يتمتع الإنزيم بالفعالية التالية: 10-15% عند 37 درجة مئوية، 30-50% عند 50 درجة مئوية، 100% عند 60-70 درجة مئوية، 30-50% عند 72 درجة مئوية. لا يُنصح باستخدام Bst 2.0 في درجات حرارة أعلى من 72 درجة مئوية لأنه يفقد فعاليته بالحرارة. س: هل يمكن تخفيف بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart® (خالي من الجلسرين) بتركيز 120,000 وحدة/مل قبل الاستخدام؟ ج: نعم، يمكن تخفيف الإنزيم بتركيز 120,000 وحدة/مل في محلول التضخيم متساوي الحرارة 1X (متوافق مع التجميد) إلى 8,000 وحدة/مل قبل الاستخدام. ويظل هذا التخفيف مستقرًا عند درجة حرارة 4 مئوية لمدة 7 أيام على الأقل. س: هل يدمج بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® dUTP؟ ج: نعم. يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® مع مزيج من dUTP وdTTP أو مع استبدال dTTP بـ dUTP بالكامل. قد يؤدي استخدام dUTP بنسبة 100% إلى تثبيط تفاعلات Bst 2.0 (انخفاض يصل إلى الضعف في زمن عتبة التضخيم)، ولكن يظل الأداء قويًا. المرجع: Kuangwen Hsieh, Peter L. Mage, Andrew T. Csordas, Michael Eisenstein, H. Tom Soh. (2014). التخلص المتزامن من التلوث المتبقي والكشف عن الحمض النووي باستخدام تضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة مُدعم بإنزيم يوراسيل-دي إن إيه جليكوزيلاز (UDG-LAMP). الجمعية الملكية للكيمياء. PubMedID: 24577617. س: هل يحتوي محلول التضخيم متساوي الحرارة B1714: 10X (متوافق مع التجفيف بالتجميد) على أي سواغات؟ ج: لا، لا يحتوي محلول التضخيم متساوي الحرارة 10X (متوافق مع التجفيف بالتجميد) على أي سواغات للتجفيف بالتجميد. يجب على المستخدم النهائي فحص السواغات واختيارها في التطبيق المطلوب. mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face {font-family:Calibri; بانوز-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4؛ mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-469750017 -1040178053 9 0 511 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat:yes; mso-style-parent:""; الهامش:0 بوصة؛ MSO-ترقيم الصفحات:أرملة يتيمة؛ حجم الخط: 12.0 نقطة؛ نوع الخط: "Times New Roman", serif؛ mso-fareast-font-family: "Times New Roman";}.MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props:yes; mso-ascii-font-family:Calibri; mso-ascii-theme-font:minor-latin; mso-fareast-font-family:Calibri; mso-fareast-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family: "Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi; mso-font-kerning:0pt; mso-ligatures:none;}div.WordSection1 {page:WordSection1; س: كيف أستخدم إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لمنع التلوث المتبقي في تفاعلات LAMP؟ ج: يتطلب منع التلوث المتبقي جزأين: دمج dUTP بواسطة بوليميراز الحمض النووي أثناء تكوين الأمبليكون، واستئصال اليوراسيل من المنتجات المضخمة وتدمير الأمبليكون بواسطة إنزيم UDG. بالنسبة لتفاعلات LAMP، يجب إجراء التفاعلات مع إضافة حوالي 50% من dUTP ممزوجًا بـ dTTP (مثل 1.4 مليمولار من dATP، dCTP، dGTP، 0.7 مليمولار من dTTP وdUTP)، ويجب استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لدمج dU بكفاءة دون تثبيط كبير للتفاعل. لتدمير المنتجات الملوثة لاحقًا، يُوصى بشدة باستخدام إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي بدلاً من إنزيم UDG الأكثر استقرارًا حراريًا في بكتيريا الإشريكية القولونية. أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP، ثم قم بإعداد وتشغيل تفاعلات LAMP كالمعتاد. سيعمل إنزيم UDG أثناء الإعداد والتسخين إلى 65 درجة مئوية على تدمير أي منتجات ملوثة بسرعة وكفاءة. في حال الحاجة إلى تطهير أكثر دقة، يمكن إضافة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في بداية سير العمل. ولتبسيط العملية، تم تضمين dUTP وUDG في مجموعة WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix المُحدثة مع UDG ومجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG). سؤال: كم عدد دورات التجميد/الذوبان التي يتحملها إنزيم Bst 2.0 WarmStart® DNA Polymerase (الخالي من الجلسرين)؟ ج: تم اختبار بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart® (خالٍ من الجلسرين) حتى 30 دورة تجميد/إذابة بتركيز 8000 وحدة/مل، ولم يُظهر أي فقدان في النشاط في تفاعل LAMP. مع ذلك، يجب تجنب التجميد والإذابة المتكررين لهذا المنتج. يمكن تخزين الإنزيم (120000 وحدة/مل) عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart®، ومتى أستخدمها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير محدد. ماذا يعني Hot Start/WarmStart؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® لدينا أبتاميرات تثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يمنع تكوين منتجات غير محددة. لا يؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين Hot Start وWarmStart هو أن إنزيمات Hot Start محبة للحرارة، بينما إنزيمات WarmStart® محبة للحرارة المعتدلة. يتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات المستخدمة في إنزيمات البدء الساخن والبدء الدافئ إلى حد كبير. الأبتاميرات عبارة عن نيوكليوتيدات قليلة مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد عبر تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النيوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تتمثل ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا يُطلق عليها اسم "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ أ: تضخيم الحمض النووي المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه الطريقة بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق متميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الحمض النووي المستهدف) مع نتائج سريعة: يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه بواسطة RNA، مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وهو ما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما الفرق بين بوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير، وBst 2.0، وBst 3.0، وبوليميراز Bst-XT DNA؟ ج: جميع البوليميرازات الأربعة هي بوليميرازات DNA متوسطة الثبات الحراري، تتميز بنشاط إزاحة السلسلة، مما يُمكّنها من إجراء تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة مثل LAMP. يُعد بوليميراز Bst 2.0 DNA نظيرًا مُصممًا حاسوبيًا لبوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير. وقد صُمم لتحسين خصائصه في تفاعلات LAMP، بما في ذلك تحمل الملوحة، والثبات الحراري، ودمج dUTP. يتميز إنزيم Bst 2.0 بدقة عالية. ويُقدم إنزيم Bst 3.0 بعض التحسينات على Bst 2.0، أبرزها سرعة تضخيم أعلى. كما يتميز Bst 3.0 بأداء مُحسّن في تفاعلات LAMP عند درجات حرارة أعلى (تصل إلى 72 درجة مئوية)، إلا أنه لا يحتفظ بدقة Bst 2.0 العالية لبعض الأهداف. أما إنزيم Bst-XT فيجمع بين أفضل خصائص Bst 2.0 وBst 3.0، حيث يوفر دقة Bst 2.0 العالية وسرعة تضخيم Bst 3.0 العالية. كما يتميز Bst-XT بنشاطه ضمن نطاق أوسع من درجات الحرارة، مما يُتيح إجراء تفاعلات LAMP بين 50 و70 درجة مئوية. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 سرعة التضخيم ★★★★★ ★★★ ★★★★★ الخصوصية ★★★★★ ★★★★★ ★★ إعداد درجة حرارة الغرفة؟ مُفعّل مُفعّل غير مُوصى به درجة حرارة LAMP المثلى 50-70 درجة مئوية 60-70 درجة مئوية 55-72 درجة مئوية متوفر خالي من الجلسرين نعم NEB #M9205 نعم NEB #M0402 نعم NEB #M0443 ★★★★★ = المنتج الأمثل والموصى به للتطبيق المحدد ★★ أو ★★★ = سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد ★ = قد يؤدي الغرض ولكن لا يُوصى به س: ما الفرق بين المحلول المنظم B1714: محلول منظم للتضخيم متساوي الحرارة 10X (متوافق مع التجفيف بالتجميد) والمحلول المنظم B0537: محلول منظم للتضخيم متساوي الحرارة 10X؟ ج: سيكون الإنزيم الخالي من الجلسرين نشطًا في كلا المحلولين المنظمين للتضخيم متساوي الحرارة، ولكن المحلول المنظم المتوافق مع التجفيف بالتجميد (NEB #B1714) مُحسَّن للاستخدام في عمليات التجفيف بالتجميد. س: ما هو تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg2+) في محلول التضخيم متساوي الحرارة 10X (المتوافق مع التجميد)؟ ج: يحتوي محلول التضخيم متساوي الحرارة 10X (المتوافق مع التجميد) على 80 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، وبالتالي 8 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم في التفاعل النهائي 1X. س: متى يُفضل استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0®؟ ج: يتميز إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 بنشاط عالٍ في إزاحة السلسلة. وهو يسد فجوة بين البوليميرازات المحبة للحرارة والبوليميرازات المحبة للحرارة المعتدلة. درجة الحرارة المثلى له، والتي تتراوح بين 60 و70 درجة مئوية، أعلى من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (Klenow) (NEB# M0210)، وأقل من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي Vent (NEB# M0254)، وهما بوليميرازان آخران لإزاحة السلسلة. وهذا يمنح الباحثين نطاقًا أوسع من ظروف التفاعل لتحسين إزاحة السلسلة وربط البادئات. يُعدّ هذا مفيدًا في تصميم استراتيجيات التسلسل وتقنيات التضخيم متساوي الحرارة. تُسهّل درجة حرارة التفاعل المرتفعة عملية التسلسل عبر المناطق الغنية بالـ GC. س: لماذا أستخدم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart®؟ ج: يوفر بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart® جميع الخصائص المحسّنة لاستخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0، مع ميزة إضافية تتمثل في إمكانية إعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة. تُظهر بوليميرازات الحمض النووي نشاطًا غير مرغوب فيه وغير مُوجّه عند درجات حرارة أقل من درجات حرارة التضخيم المُحدّدة، ويمكن أن يؤثر هذا النشاط بشكل كبير على الأداء وقابلية التكرار. يعمل الأبتامر الموجود في Bst 2.0 WarmStart® على تثبيط نشاط بوليميراز الحمض النووي عند درجات حرارة أقل من 45 درجة مئوية، وبالتالي يمكن إعداد التفاعلات في درجة حرارة الغرفة.