نيو إنجلاند بيولابس، M0437M، إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 1 (إنزيم ربط الحمض النووي الريبي الصغير)، تركيز عالٍ

يتوفر أيضًا إصدار بتركيز عادي (10000 وحدة/مل) من هذا الإنزيم، وهو T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase). ( الفئات ذات الصلة: تطبيقات ربط الحمض النووي الريبي، استنساخ الحمض النووي الريبي ، المواصفات، المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: مثبط RNase، فأري (NEB #M0314) (اختياري)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500)، DMSO نقي 100%). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحويل 1 نانومول من 5´- [32P rA 16] إلى شكل مقاوم للفوسفاتاز في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، مضاف إليه 1 ملي مول من ATP، يُحضن عند 25 درجة مئوية. محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، 50 ملي مول من Tris-HCl، 10 ملي مول من MgCl2، 1 ملي مول من DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية) محلول التخزين: 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين. الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. شروط اختبار الوحدة: يُخلط محلول تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، مُضافًا إليه 1 ملي مولار ATP، مع ركيزة RNA (10 ميكرومولار من 5´-[32P]rA 16) وكميات متفاوتة من الإنزيم. تتم الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (8). الأسئلة الشائعة : س: ما هي درجة حرارة ووقت التفاعل الأمثل لإنزيم T4 RNA Ligase I؟ ج: بشكل عام، يؤدي زيادة وقت التفاعل وخفض درجة حرارة التفاعل إلى تفاعلات ربط أكثر اكتمالًا. يجب إجراء تفاعل الربط النموذجي عند 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى ساعتين. بالنسبة للأوليغومرات الأطول، يلزم حضانة لمدة ساعتين. قد يؤدي التسخين عند 25 درجة مئوية متبوعًا بحضانة ليلية عند 16 درجة مئوية إلى تحسين المردود. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لوسم نهايات الحمض النووي أحادي السلسلة (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لوسم النهاية 3' للحمض النووي الريبي أحادي السلسلة (ssRNA). ويمكن استخدام إنزيم Terminal Transferase (#M0315) لوسم النهاية 3' للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). ويمكن استخدام إنزيم T4 PNK (#M0201) لوسم النهاية 5' للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). س: هل يقوم إنزيم T4 RNA Ligase 1 بربط الحمض النووي ثنائي السلسلة (DNA)؟ ج: لا، ليس بشكل ملحوظ. على عكس التقارير السابقة، لا يُحسّن إنزيم T4 RNA Ligase 1 ربط النهايات غير المتداخلة بشكل ملحوظ عند استخدامه مع إنزيم T4 DNA Ligase 1. (1). (1) Sugino, A. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3987-3994. س: ما هو السبب الأكثر شيوعًا س: لماذا يحدث فشل في الربط عند استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1؟ ج: قد يؤدي وجود بنية ثانوية للحمض النووي الريبي (RNA) تحجب الأطراف إلى تثبيط عملية الربط. يمكن زيادة الربط في هذه الحالات بإضافة DMSO بنسبة 10% (حجم/حجم). س: لماذا لا يحتوي محلول تفاعل إنزيم T4 RNA Ligase الجديد على ATP؟ ج: لتوفير مرونة أكبر للعملاء في استخدام هذا المنتج، نوفر الآن محاليل ATP بتركيز 10 ملي مولار وPEG8000 بنسبة 50% كمكونات منفصلة عن محلول الإنزيم. كما أن محلول تفاعل إنزيم T4 RNA Ligase (NEB #B0216) متوافق مع إنزيم T4 RNA Ligase 2، المختزل (NEB #M0242) وإنزيم T4 RNA Ligase 2، المختزل K227Q (NEB #M0351). س: هل يقوم إنزيم T4 RNA Ligase 1 بربط الحمض النووي أحادي السلسلة؟ ج: نعم. التفاعل أبطأ من تفاعل RNA/RNA أو RNA/DNA. على سبيل المثال، يمكن أن تؤدي البادئات إلى فشل الربط. يتم ربطها بـ cDNA (2). (2) Troutt, AB, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89. pp. 9823-9825. س: هل سينتج عن تفاعل الربط باستخدام T4 RNA Ligase 1 حلقات أم منتجات مزدوجة؟ ج: يمكن أن ينتج التفاعل كليهما. تُعرَّف الوحدة بإنتاج حلقات باستخدام rA-20mer كركيزة. يمكن أن تؤدي زيادة التركيز والطول وإضافة PEG إلى زيادة عدد عمليات الربط بين الجزيئات. سيؤدي حجب أحد طرفي الجزيء باستخدام مُنهي ثنائي الديوكسي إلى منع الجزيء من تكوين حلقة. س: هل يمكن استخدام T4 RNA Ligase 1 لصنع هجائن RNA/DNA أحادية السلسلة؟ ج: نعم. س: هل يمكن لـ T4 RNA Ligase 1 ربط ثلاثي الفوسفات؟ ج: لا. ومع ذلك، يمكن معالجة RNA أولاً بـ CIP لإزالة ثلاثي الفوسفات، ثم باستخدام كيناز لإضافة فوسفات أحادي. يمكن ربط الشظايا التي تحتوي على هذه الفوسفات الأحادية في الطرف 5' بواسطة إنزيم T4 RNA Ligase 1. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لإضافة ذيول إلى الحمض النووي المزدوج الخطي؟ ج: نعم، يمكن ربط قليل النوكليوتيدات RNA بالحمض النووي المزدوج ذي النهايات غير المتداخلة أو المتماسكة. يتم ربط قليل النوكليوتيدات DNA بمعدل منخفض للغاية (3). (3) Higgins, NP et al. (1979) NAR 6, pp. 1013-1024. س: هل يمكن استخدام ثنائي ديوكسي لمنع الربط باستخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1؟ ج: نعم (2). (2) Troutt, AB, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, pp. 9823-9825. س: هل يمكن استخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1 لإدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية في البروتينات؟ ج: نعم، انظر المرجع نورين، سي جيه وآخرون (1989) ساينس 244، 182-188. س: هل يُحسّن البولي إيثيلين جلايكول (PEG) عملية الربط باستخدام إنزيم T4 RNA Ligase 1؟ ج: نعم (4)، يمكن استخدام محلول منظم مجموعة الربط السريع (NEB# M2200) مع إنزيم T4 RNA Ligase 1. (4) هاريسون، ب.، وزيمرمان، إس بي، (1984) NAR 12، 8235-8251. س: هل البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG) متوفر للشراء؟ ج: يُدرج البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG) كمكون في محلول منظم تفاعل إنزيم T4 RNA Ligase (NEB #B0216).