نيو إنجلاند بيولابس، M0460T، بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (تركيز عالٍ)

النسخ باستخدام محفز العاثية T7 الفئات ذات الصلة تخليق الحمض النووي الريبي النسخ في المختبر (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات لتطبيقات الحمض النووي الريبي التضخيم بوساطة النسخ وتضخيم NASBA المواصفات تعريف الوحدة تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 1 نانومول من ATP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X: 40 ملي مولار Tris-HCl، 6 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT، 2 ملي مولار سبيرميدين (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 20 ملي مولار β-ME، 1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% (وزن/حجم) Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل RNAPol بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من كل من ATP وUTP وGTP وCTP، و1 ميكروغرام من حمض T7 DNA في 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: ما هو تسلسل المحفز لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7؟ ج: مُحفِّز T7 5′ TAATACGACTCACTATAG 3′ يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 عملية النسخ عند النيوكليوتيد G المُسطَّر في تسلسل المُحفِّز. ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام الشريط المقابل كقالب من 5′ إلى 3′. ستكون القاعدة الأولى في النسخة هي G. س: هل من الممكن بدء النسخ بالنيوكليوتيد A؟ ج: يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بدء النسخ بالنيوكليوتيد A تحت مُحفِّز T7 من الفئة الثانية. على غرار مُحفِّز T7 العادي، يُفضَّل وجود النيوكليوتيد G في الموضعين الثاني والثالث. مُحفِّز T7 من الفئة الثانية 5′- TAATACGACTCACTATTA 3′ س: هل يتطلب تفاعل النسخ باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بادئًا؟ ج: لا، يتعرف بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على تسلسل المُحفِّز الخاص به ويبدأ النسخ عند النيوكليوتيد G الأخير. ثم يقوم البوليميراز بالنسخ باستخدام الشريط المقابل كقالب من 5′ إلى 3′. س: هل يترك إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 قاعدة إضافية في نهاية النسخة؟ ج: نعم، يمكن لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 إضافة قاعدة أو بضع قواعد إضافية في نهاية النسخة، مما ينتج عنه مجموعة من النسخ ذات نهايات 3' غير متجانسة. س: هل يعمل إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على ركيزة أحادية السلسلة؟ ج: لا، يجب أن تكون منطقة تسلسل المحفز ثنائية السلسلة. س: هل يعمل إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 على الحمض النووي البلازميدي غير المقطوع؟ ج: نعم، ولكن إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 هو إنزيم شديد التكرار، وسيستمر في النسخ حول قالب دائري عدة مرات دون أن ينفصل. يمكن تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو نتوءًا 5' في اتجاه مجرى الحمض النووي المطلوب. س: هل يمكن إنتاج حمض نووي ريبي شاذ عند استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7؟ ج: لوحظ وجود RNA شاذ عندما ينتج عن إنزيم التقييد المستخدم لتخطيط البلازميد أسفل الحمض النووي المستهدف نتوء 3'. لتجنب ذلك، يجب قطع البلازميد بإنزيم تقييد يترك نتوءًا غير لاصق أو نتوء 5' أسفل الحمض النووي المستهدف. س: كيف يمكن زيادة إنتاجية RNA إلى أقصى حد عند استخدام بوليميراز T7 RNA؟ ج: يمكن الحصول على إنتاجية أعلى من RNA عن طريق رفع تركيزات النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (حتى 4 ملي مولار لكل منها). يجب رفع تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg2+) إلى 4 ملي مولار فوق إجمالي تركيز النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة بيروفوسفاتاز غير عضوي بتركيز نهائي قدره 4 وحدات/مل لتقليل التثبيط الارتجاعي. س: هل يمكنني استخدام بوليميراز T7 RNA لصنع مجسات موسومة إشعاعيًا ذات نشاط نوعي عالٍ؟ ج: نعم، يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، وبوليميراز الحمض النووي الريبي SP6، وبوليميراز الحمض النووي الريبي T3، بالإضافة إلى مجموعة HiScribe T7 (NEB #E2040) لصنع مجسات الحمض النووي الريبي. ويمكن الحصول على حساسية كشف أعلى للأحماض النووية باستخدام مجس الحمض النووي الريبي نظرًا لاستقرار هجائن الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين بشكل أكبر من هجائن الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين. س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7؟ ج: بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 حساس للغاية لتثبيط الأملاح. يجب ألا يتجاوز تركيز الملح أحادي التكافؤ 20 ملي مولار. يجب تحضير قالب الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين خاليًا من الأملاح. يؤدي تلوث إنزيم RNase إلى تحلل منتج الحمض النووي الريبي. نوصي باستخدام مثبط إنزيم RNase (NEB #0314 أو #M0307) في التفاعل بتركيز وحدة واحدة/ميكرولتر. استخدم ماءً فائق النقاء، وتأكد من استخلاص قالب الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين باستخدام الفينول/الكلوروفورم. س: لماذا النشاط النوعي للمجس منخفض؟ أ: يجب أن يكون تركيز النيوكليوتيد المشع محدودًا (6 ميكرومول). بمعنى آخر، عند استخدام ATP الموسوم، أضف 500 ميكرومول من UTP وCTP وGTP، ولكن 6 ميكرومول فقط من ATP في عملية النسخ، بحيث يتم دمج ATP بنسبة أعلى، مما ينتج عنه مسبار RNA عالي الإشعاع.