نيو إنجلاند بيولابس، M0464S، OGG مقاوم للحرارة

الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية الخاصة بالبنية. تعريف الوحدة: تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لقطع 10 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 60 قاعدة موسومة بالفلورة يحتوي على قاعدة 8-أوكسوجوانين واحدة مقترنة بسيتوزين في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 65 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 65 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار من أسيتات التريس، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار من Tris-HCl، 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار من EDTA، 1 ملي مولار من DTT، 200 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين OGG المقاوم للحرارة (NEB #M0464) وFpg (NEB #M0240)؟ ج: كل من Fpg و OGG المقاوم للحرارة هما إنزيمات غليكوزيلاز ثنائية الوظيفة، أي أن نشاط الغليكوزيلاز يتعرف أولاً على القاعدة المعدلة في الحمض النووي ويزيلها، ثم يقوم نشاط AP-lyase بقطع هيكل الحمض النووي. يتميز OGG المقاوم للحرارة، على عكس FPG، بثباته الحراري (نشط في درجات حرارة تصل إلى 80 درجة مئوية)، وبينما يتشابه الإنزيمان في خصوصية الركيزة (كلاهما يتعرف على 8-أوكسوجوانين ويقطعه)، إلا أنهما يقطعان هيكل الحمض النووي بطريقة مختلفة. يقطع OGG المقاوم للحرارة الرابطة 3′ لقاعدة 8-أوكسوجوانين، مما يُحدث شقًا في ركيزة الحمض النووي مع مجموعة فوسفات 5′ ومجموعة فوسفات 3′-α، β-ألدهيد غير مشبع. أما Fpg فيقطع كلا الطرفين 5′ و 3′′ للقاعدة المعدلة، فتطفو القاعدة المعدلة بعيدًا، مُحدثةً فجوة في الحمض النووي بطول نيوكليوتيد واحد مع نهايات فوسفات 5′ و 3′. س: ما هو نشاط إنزيم OGG المقاوم للحرارة في المحاليل المنظمة الأخرى؟ ج: يتمتع إنزيم OGG المقاوم للحرارة بنشاط في المحاليل المنظمة التالية: NEBuffer r1.1 = نشاط 100%، NEBuffer r2.1 = نشاط 75%، NEBuffer r3.1 = نشاط 50%، rCutSmart Buffer = نشاط 100%، Thermopol Buffer = نشاط 100%. س: هل يقوم إنزيم OGG المقاوم للحرارة بقطع 8-أوكسوجوانين المرتبط بقاعدة أخرى غير السيتوزين؟ ج: على الرغم من أن إنزيم OGG المقاوم للحرارة يقطع بشكل تفضيلي عند القاعدة المعدلة (8-أوكسوجوانين) عندما تكون مرتبطة بالسيتوزين (C)، إلا أن الإنزيم سيقطع عند 8-أوكسوجوانين بغض النظر عن القاعدة المرتبطة به. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم OGG المقاوم للحرارة؟ ج: الوزن الجزيئي لإنزيم OGG المقاوم للحرارة هو 31376 دالتون. س: هل بروتين Thermostable OGG مُوسَم؟ ج: نعم، يحتوي بروتين Thermostable OGG على وسم سداسي الهيستيدين في الطرف الكربوكسيلي. س: ما الركيزة المستخدمة لاختبار بروتين Thermostable OGG؟ ج: الركائز المستخدمة لاختبار نشاط الإنزيم مُدرجة ضمن تعريف الوحدة لكل إنزيم. يُختبر بروتين Thermostable OGG باستخدام جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 60 قاعدة، مُوسَم بمادة فلورية، يحتوي على قاعدة 8-أوكسوجوانين واحدة مُقترنة بالسيتوزين. س: هل يقطع بروتين Thermostable OGG أحد الشريطين فقط، أم كليهما، لإحداث كسر مزدوج؟ ج: يقطع بروتين Thermostable OGG الشريط الذي يحتوي على التلف فقط. إذا كان هناك تلف في كلا الشريطين، فسيقطعهما معًا. س: ما القواعد المُعدلة التي يتعرف عليها بروتين Thermostable OGG ويقطعها؟ ج: يتعرف بروتين Thermostable OGG تحديدًا على قاعدة 8-أوكسوجوانين ويقطعها. لن يقوم إنزيم OGG المقاوم للحرارة بقطع القواعد المعدلة الأخرى، بما في ذلك 8-أوكسوأدينين، و5-هيدروكسي سيتوزين، و5-هيدروكسي يوراسيل، أو ثايمين جليكول. س: هل يقوم إنزيم OGG المقاوم للحرارة بقطع 8-أوكسوغوانين في الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)؟ ج: نعم، يقوم إنزيم OGG المقاوم للحرارة بقطع الحمض النووي أحادي السلسلة الذي يحتوي على 8-أوكسوغوانين، إلا أن فعاليته على الحمض النووي أحادي السلسلة تنخفض بشكل ملحوظ (حوالي 32 ضعفًا) مقارنةً بفعاليته على الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA). س: ما هي درجات الحرارة التي يكون فيها إنزيم OGG المقاوم للحرارة فعالًا؟ ج: يكون إنزيم OGG المقاوم للحرارة فعالًا بين 25 و80 درجة مئوية، ولكن يُلاحظ النشاط الأمثل بين 65 و75 درجة مئوية. درجة الحرارة (°C) الوحدات/مل 16 1000 25 1000 37 2500 42 4500 50 5500 60 7000 65 8000 70 8000 75 8000 80 6000 يعتمد النشاط عند درجات الحرارة المختلفة على تعريف وحدة القياس: كمية الإنزيم المطلوبة لقطع 10 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج موسوم بالفلورة مكون من 60 قاعدة، يحتوي على قاعدة 8-أوكسوجوانين واحدة مقترنة بالسيتوزين، في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر في ساعة واحدة.