نيو إنجلاند بيولابس، M0466L، مزيج إنزيم النسخ العكسي لتبديل القالب

يُمكّن مزيج إنزيم النسخ العكسي المُبدّل للقالب ومحلول التفاعل المُصاحب له من إجراء تبديل فعال للقالب في تفاعل النسخ العكسي. يحتوي المزيج على إنزيم نسخ عكسي فريد ومثبط RNase فأري. على عكس منتجات النسخ العكسي المنافسة، لا يتطلب هذا المزيج أي إضافات (مثل PEG أو البيتايين) لتحقيق الأداء الأمثل، مما يُبسط إعداد التفاعل. بالاقتران مع قليل النوكليوتيدات المُبدّل للقالب (TSO)، يتم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) بتسلسل معروف مُختار مُرتبط بالنهاية 3′. يمكن تضخيم الحمض النووي التكميلي الناتج بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو استخدامه كقالب لتقنية 5′ RACE (التضخيم السريع لنهايات الحمض النووي التكميلي). فئتان ذوات صلة : تخليق الحمض النووي التكميلي وإنزيمات النسخ العكسي، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتقنيات التضخيم. تطبيقات: تخليق الحمض النووي التكميلي، النسخ العكسي (تخليق الحمض النووي التكميلي). المواصفات: التثبيط الحراري 80 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: هل أحتاج إلى إضافة مثبط RNase إلى تفاعل النسخ العكسي عند استخدام مزيج إنزيم النسخ العكسي المُبدّل للقالب؟ ج: يحتوي مزيج إنزيم النسخ العكسي لتبديل القالب على مثبط RNase الفأري. إذا كانت المادة الأولية هي RNA، فلا حاجة إلى مثبط RNase إضافي. أما إذا كانت المادة الأولية خلايا/أنسجة، فيُرجى اتباع تعليمات تحلل الخلايا أو عزل RNA، والتي قد تتطلب مثبط RNase. س: تصف العديد من المنشورات إضافة مواد مختلفة (مثل البيتايين وPEG) لتحسين تبديل القالب. هل يمكنني إضافة أي منها إلى تفاعلي؟ ج: تم تحسين مزيج إنزيم النسخ العكسي لتبديل القالب والمحلول المنظم بشكل مكثف لتبديل القالب. ولأن هذا التطوير قد تم بالفعل، فإننا نلاحظ عمومًا أفضل أداء في الكواشف كما هي مُقدمة. س: هل مزيج إنزيم النسخ العكسي لتبديل القالب متوافق مع بادئات النسخ العكسي ذات القواعد المتغيرة لتخليق وتضخيم cDNA، كما هو موضح في طريقة mcSCRB [1]؟ أ: قارنّا أداء مزيج إنزيم النسخ العكسي ذي التبديل القالب (TEM) وإنزيم النسخ العكسي Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific). تحتوي مكتبات الحمض النووي المكمل (cDNA) المُحضّرة باستخدام مزيج إنزيم النسخ العكسي ذي التبديل القالب من NEB على ما لا يقل عن 10% من النسخ أكثر من تلك المُحضّرة باستخدام Maxima H Minus المُدعّم بـ 7.5% من بولي إيثيلين جلايكول (PEG) كما هو موضح في طريقة mcSCRB. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت مكتبات NEB تحسّنًا في مقاييس توزيع قواعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) كما هو مُدرج أدناه: خيارات النسخ العكسي % إكسون % rRNA % إنترون % بين الجينات NEB 77.8±0.3 2.1±0.3 10.3±0.0 9.7±0.0 mcSCRB 50.0±1.8 24.8±1.8 9.8±0.2 15.4±0.2 1 Bagnoli, JW. et al. (2018) Nat Commun. ٢٩٣٧-٢٩٤٤. س: ما نوع قليل النوكليوتيدات المُبدِّلة للقالب (TSOs) المتوافقة مع مزيج إنزيم النسخ العكسي المُبدِّل للقالب؟ ج: بشكل عام، يمكن استخدام أنواع مختلفة من قليل النوكليوتيدات المُبدِّلة للقالب، بما في ذلك تلك التي تحتوي على تعديلات في الطرف ٥′، مثل البيوتين، أو القواعد المتماثلة، أو الفواصل الخالية من القواعد. نوصي باستخدام قليل النوكليوتيدات المُبدِّلة للقالب الذي يحتوي على rGrGrG في الطرف ٣′ لتبديل القالب بكفاءة، ولكن أنواعًا/تسلسلات مختلفة من قليل النوكليوتيدات المُبدِّلة للقالب متوافقة مع مزيج إنزيم النسخ العكسي المُبدِّل للقالب. تجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة للتضخيم اللاحق باستخدام بوليميرازات عائلة B الأثرية (مثل Q5® وPhusion®)، قد يتسبب قليل النوكليوتيدات المُبدِّلة للقالب الذي يحتوي على بقايا rU في حدوث تثبيط. لمزيد من المعلومات حول التطبيقات المحددة، يُرجى الرجوع إلى الإرشادات العامة/قليل النوكليوتيدات المُبدِّلة للقالب في البروتوكول ذي الصلة. س: هل يمكنني استخدام مزيج إنزيم النسخ العكسي المُبدِّل للقالب لتفاعلات النسخ العكسي العادية؟ ج: يمكن استخدام هذا المنتج أيضًا في تفاعل تخليق السلسلة الأولى بشكل عام عن طريق حذف TSO، ولكن من المرجح أن تكون هناك منتجات أخرى أكثر ملاءمة لهذه التفاعلات. للاطلاع على المنتجات الموصى بها حسب التطبيق، يرجى زيارة: https://www.neb.com/tools-and-resources/selection-charts/cdna-synthesis-selection. س: ما هي كفاءة تبديل القالب عند استخدام مزيج إنزيم النسخ العكسي لتبديل القالب؟ ج: تختلف كفاءة تبديل القالب بناءً على التسلسلات المستهدفة. نلاحظ عادةً كفاءة تتراوح بين 20-60% عند قياسها بتقنية qPCR. س: هل يعمل مزيج إنزيم النسخ العكسي لتبديل القالب مع الحمض النووي الريبوزي بدائيات النوى؟ ج: نعم، يمكن استخدام مزيج إنزيم النسخ العكسي لتبديل القالب مع الحمض النووي الريبوزي بدائيات النوى. ومع ذلك، ستكون كفاءة تبديل القالب للحمض النووي الريبوزي بدائيات النوى، الذي تحتوي نسخه الأولية على 5'-PPP، أقل مقارنةً بالحمض النووي الريبوزي الرسول حقيقيات النوى ذي بنية الغطاء. س: هل يعمل مزيج إنزيم النسخ العكسي مع تبديل القالب مع الحمض النووي الريبي المجزأ؟ ج: تعتمد ملاءمة الحمض النووي الريبي المجزأ كمادة أولية على التطبيق/السؤال المطروح. بالنسبة لتقنية 5′ RACE وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من السلسلة الثانية، يلزم استخدام الحمض النووي الريبي السليم للحفاظ على موقع بدء النسخ بالكامل. أما بالنسبة لتضخيم الحمض النووي المكمل، فيمكن استخدام الحمض النووي الريبي المجزأ كمدخل، إلا أن كفاءة تبديل القالب تكون أقل بالنسبة للحمض النووي الريبي الذي يفتقر إلى بنية غطاء. س: ما نوع بادئات النسخ العكسي التي يمكن استخدامها مع مزيج إنزيم النسخ العكسي مع تبديل القالب؟ ج: بشكل عام، يمكن أن تكون بادئات النسخ العكسي متعددة (dT)، أو سداسية عشوائية، أو خاصة بجين معين. بالنسبة لتضخيم الحمض النووي المكمل، يجب أن تحتوي بادئة النسخ العكسي على مقبض تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذي تسلسل معروف لتضخيم الحمض النووي المكمل لاحقًا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. س: هل يمكنني تقليل وقت تفاعل النسخ العكسي؟ ج: لا يُنصح بتقليل وقت تفاعل النسخ العكسي لأنه من المحتمل أن يقلل من كمية الحمض النووي المكمل المطلوب.