نيو إنجلاند بيولابس، M0467L، إنزيم ربط الحمض النووي Salt-T4®

هل تبحث عن تركيبات وأنواع إضافية من إنزيم T4 DNA Ligase؟ الفئات ذات الصلة: تطبيقات إنزيمات ربط الحمض النووي، BioBrick®، التجميع، ربط الاستنساخ، NEBridge® Golden Gate Assembly. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحقيق ربط 50% من 6 ميكروغرام من حمض Lambda-HindIII DNA في 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكروغرام في محلول تفاعل T4 DNA Ligase بتركيز 1X مُضاف إليه 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي T4 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي T4: 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار ATP، 10 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما هي بعض أسباب فشل تفاعل الربط التي قد تؤدي إلى فشل التحويل؟ ج: فشل الربط بسبب عدم وجود ATP أو Mg2+. استخدم المحلول المرفق أو أضف ATP إلى محلول متوافق. قد يكون ATP الموجود في المحاليل التي يزيد عمرها عن عام قد تحلل بدرجة كافية للتسبب في مشاكل. عند إضافة ATP، تأكد من استخدام riboATP لأن deoxyriboATP لن يعمل. فشلت عملية الربط بسبب وجود EDTA في التفاعل. نظّف الحمض النووي (نوصي باستخدام مجموعات تنقية الأحماض النووية Monarch®). لم يتم تعطيل CIP أو BAP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي أو SAP بشكل كامل بعد خطوة إزالة الفوسفات. اتبع الإجراء الموصى به لإزالة الفوسفاتاز. كان التركيز مرتفعًا جدًا مما أدى إلى إنتاج حمض نووي خطي فقط أثناء الربط. حافظ على تركيز الحمض النووي الكلي بين 1-10 ميكروغرام/مل. لا يحتوي كل من الجزء المُدخل والبلازميد على مجموعات فوسفات. ملاحظة: قد لا تحتوي البادئات على مجموعات فوسفات، مما يمنع الربط ذي النهايات غير المتداخلة مع النواقل التي عولجت بـ CIP. اطلب بادئات تحتوي على مجموعات فوسفات أو قم بفسفرة البادئات باستخدام كيناز عديد النوكليوتيد T4 قبل الاستخدام. تمت إضافة كمية كبيرة جدًا من خليط الربط إلى الخلايا. أضف ما بين 1-5 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. كان الجزء المُدخل كبيرًا ولم تسمح الظروف بتكوين حلقة. قلل تركيز الجزء المُدخل. كان الليغاز غير نشط. اختبر على حمض نووي Lambda HindIII أو أي ركيزة مناسبة أخرى. احتوى مزيج الربط على بولي إيثيلين جلايكول (PEG) وتم تحضينه طوال الليل. يؤدي الربط المطول باستخدام PEG إلى انخفاض كفاءة التحويل. قد يعود ذلك إلى الإنتاج التدريجي لقطع خطية كبيرة من الحمض النووي التي قد تعيق التحويل. يحتوي محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer على PEG. لم يتم تنقية مزيج الربط قبل التحويل الكهربائي. يجب إزالة المحلول وإلا سيحدث شرر كهربائي بسبب الملح. قم بغسل العينة بالترشيح الغشائي أو استخدم عمودًا دوارًا للتنقية (نوصي باستخدام مجموعات تنقية الأحماض النووية Monarch). يمنع PEG الموجود في محلول StickTogether™ DNA Ligase حدوث الشرر، ولكنه يمنع أيضًا التحويل الكهربائي. يجب إزالة PEG باستخدام عمود دوار. س: متى يُفضل استخدام إنزيم Salt-T4 DNA Ligase؟ ج: بينما يتأثر إنزيم T4 DNA Ligase بوجود الملح في التفاعل، فإن إنزيم Salt-T4 DNA Ligase يتحمل تركيزات ملحية تصل إلى 500 ملي مولار لربط النهايات المتماسكة، أو حتى 150 ملي مولار لربط النهايات غير المتماسكة. لذلك، يُنصح باستخدام إنزيم Salt-T4 DNA Ligase إذا كان الربط سيتم في محلول منظم يحتوي على الملح (مثل NEBuffer 3.1) أو إذا كان هناك احتمال لانتقال الملح (من مستحضرات الحمض النووي) يُشكل مصدر قلق. يُرجى ملاحظة أنه في وجود PEG (محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer بتركيز 1X)، سيترسب الحمض النووي في محلول عالي الملح، مما يُعيق عملية الربط. إذا كنت ترغب في ربط الحمض النووي في وجود ملح بتركيز يزيد عن 100 ملي مولار، نوصي باستخدام محلول T4 DNA Ligase Buffer بتركيز 1X. س: ما هو المحلول المنظم الذي يجب استخدامه مع إنزيم Salt-T4 DNA Ligase؟ ج: عند محاولة ربط النهايات المتماسكة أو النهايات غير المتماسكة في وجود تركيز ملح يزيد عن 100 ملي مولار، نوصي باستخدام إنزيم Salt-T4 DNA Ligase في محلول T4 DNA Ligase Buffer بتركيز 1X. أما عند محاولة ربط النهايات غير المتماسكة أو النهايات ذات القاعدة الواحدة البارزة، فيجب استخدام إنزيم Salt-T4 DNA Ligase في محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer. لا نوصي بإضافة تركيز ملح يزيد عن 100 ملي مولار إلى محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer، لأن مادة PEG الموجودة في المحلول والحمض النووي ستترسب، مما يعيق عملية الربط. عند محاولة ربط الحمض النووي في وجود تركيز ملح يزيد عن 100 ملي مولار، نوصي باستخدام محلول T4 DNA Ligase Buffer بتركيز 1X. تجنب إيقاف التفاعل بالحرارة، لأن معالجة PEG بالحرارة في محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer ستعيق عملية التحويل. س: ما هو نشاط إنزيم Salt-T4 DNA Ligase في محاليل أخرى؟ أ: إنزيم Salt-T4 DNA Ligase نشط بنسبة 100% في محلول T4 DNA Ligase Buffer المُضاف إليه 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، ومحلول NEBuffer r3.1، ومحلول HiFi Taq DNA Ligase Buffer (عند إضافة ATP). يُظهر إنزيم Salt-T4 DNA Ligase نشاطًا منخفضًا في محاليل إنزيمات التقييد والربط الأخرى من NEB، إلا أنه يمكن استعادة نشاطه في هذه المحاليل عند إضافة 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. نسبة النشاط في المحلول المنظم 1 محلول منظم لإنزيم ربط الحمض النووي T4 مضاف إليه 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم 100% محلول منظم لإنزيم ربط الحمض النووي T4 25% محلول منظم NEBuffer r1.12 25% محلول منظم NEBuffer r1.12 مضاف إليه 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم 100% محلول منظم NEBuffer r2.12 50% محلول منظم NEBuffer r2.12 مضاف إليه 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم 100% محلول منظم NEBuffer r3.12 100% محلول منظم rCutSmart® 2 25% محلول منظم rCutSmart 2 مضاف إليه 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم 100% محلول منظم Taq DNA Ligase 2 25% محلول منظم HiFi Taq DNA Ligase 2 100% 1 النشاط النسبي للنشاط على ركيزة طرفية متماسكة في محلول منظم لإنزيم ربط الحمض النووي T4 مضاف إليه 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم (25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق). ٢- مُضاف إليه ١ ملي مول من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). يُرجى التأكد من استخدام ريبوأدينوسين ثلاثي الفوسفات (NEB #P0756) لأن ديوكسي ريبوأدينوسين ثلاثي الفوسفات (DNA) لن يعمل. لمعرفة نسبة نشاطه الوظيفي في CutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®. س: هل يمكن تعطيل هذا الليغاز بالحرارة؟ ج: نعم، تمامًا مثل ليغاز الحمض النووي T4، يمكن تعطيل هذا الليغاز بالحرارة لمدة ١٠ دقائق عند ٦٥ درجة مئوية. لا تقم بتعطيله بالحرارة إذا كان هناك بولي إيثيلين جلايكول (PEG) في محلول التفاعل (محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer)، حيث سيتم تثبيط عملية التحويل. س: ما الفرق بين تعريفات وحدات ليغاز الحمض النووي T4 (NEB #M0202) وليغاز الحمض النووي Salt-T4 (NEB #M0467)؟ ج: يُعرَّف كلٌّ من إنزيم T4 DNA Ligase وإنزيم Salt-T4 DNA Ligase بوحدة ربط بنسبة 50% لقطع HindIII بتركيز 0.12 ميكرومولار، إلا أن وقت/درجة حرارة الحضانة، وظروف المحلول المنظم، بالإضافة إلى طريقة الكشف عن نواتج الربط، تختلف. تُحدَّد وحدة إنزيم T4 DNA Ligase بعد 30 دقيقة عند 16 درجة مئوية، بينما تُحدَّد وحدة إنزيم Salt-T4 DNA Ligase بعد 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. يتمتع كلٌّ من إنزيم T4 DNA Ligase و Salt-T4 DNA Ligase بنفس النشاط النوعي (وحدة واحدة من إنزيم Salt-T4 DNA Ligase في محلول منظم T4 DNA Ligase بتركيز 1X + 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم = وحدة واحدة من إنزيم T4 DNA Ligase في محلول منظم T4 DNA Ligase بتركيز 1X). س: ما كمية الحمض النووي (DNA) التي يجب استخدامها في عملية الربط باستخدام هذا الإنزيم؟ ج: يستخدم تعريف الوحدة 6 ميكروغرام من قطعة HindIII. يمكن استخدام هذا التركيز العالي من الحمض النووي لربط الروابط. لتعزيز تكوين الدوائر، وهو أمر مفيد في عملية التحويل، يُنصح باستخدام تركيز إجمالي منخفض للحمض النووي. يجب أن يتراوح التركيز الإجمالي للناقل + القطعة المُدخلة بين 1 و10 ميكروغرام/مل لضمان ربط فعال. يُوصى بنسب مولية للناقل إلى القطعة المُدخلة تتراوح بين 1:1 و1:10 (1:3 هي النسبة النموذجية). إذا لم تكن متأكدًا من تركيزات الحمض النووي، فقم بإجراء عمليات ربط متعددة بنسب مختلفة. سؤال: هل يتمتع إنزيم Salt-T4 DNA Ligase بتحمل أعلى للأملاح مقارنةً بأنواع الليغاز الأخرى؟ جواب: نعم. في حين أن إنزيم T3 DNA Ligase يتحمل تركيزات ملحية تصل إلى 250-300 ملي مولار في التفاعل، فإن إنزيم Salt-T4 DNA Ligase يتحمل تركيزات ملحية تصل إلى 500 ملي مولار في التفاعل لربط النهايات المتماسكة، وتركيزات ملحية تصل إلى 150 ملي مولار لربط النهايات غير المتماسكة. يُرجى ملاحظة أنه في وجود بولي إيثيلين جلايكول (مثل محلول StickTogether™ DNA Ligase Buffer)، سيترسب الحمض النووي في محلول ملحي عالي التركيز، مما يُعيق عملية الربط. إذا كنت ترغب في ربط الحمض النووي في وجود تركيز ملح يزيد عن 100 ملي مولار، فننصح باستخدام محلول منظم T4 DNA Ligase بتركيز 1X. س: هل يمكن استخدام ناتج تفاعل الربط الناتج عن Salt-T4 DNA Ligase مباشرةً لتحويل الخلايا المؤهلة كهربائيًا؟ ج: ننصح بتنقية ناتج تفاعل الربط قبل التحويل الكهربائي. يجب إزالة المحلول المنظم وإلا سيحدث شرر كهربائي بسبب الملح الموجود. قم بغسل العينة بالترشيح الغشائي أو استخدم عمودًا دوارًا للتنقية (ننصح باستخدام مجموعات تنقية الأحماض النووية من Monarch). يمنع البولي إيثيلين جلايكول (PEG) الموجود في محلول StickTogether™ DNA Ligase حدوث الشرر، ولكنه يمنع أيضًا التحويل الكهربائي، ويجب إزالته باستخدام عمود دوار.