نيو إنجلاند بيولابس، M0470T، بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7® (تركيز عالٍ)

تم تصميم بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 للفئات ذات الصلة : تخليق الحمض النووي الريبي، النسخ المختبري (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات لتطبيقات الحمض النووي الريبي، التضخيم بوساطة النسخ وتضخيم NASBA. المواصفات: تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لدمج 1 نانومول من ATP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال ساعة واحدة عند 50 درجة مئوية. شروط التفاعل : محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7® بتركيز 1X، يُحضن عند 50 درجة مئوية. محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7® بتركيز 1X: 40 ملي مولار Tris-HCl، 4 ملي مولار MgCl2، 50 ملي مولار NaCl، 2 ملي مولار سبيرميدين، 1 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، 0.1% (وزن/حجم). Triton® X-100، درجة الحموضة 7.9 عند 25 درجة مئوية. شروط اختبار الوحدة: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مول من كل من ATP وUTP وGTP وCTP و1 ميكروغرام من الحمض النووي لفيروس T7 في حجم تفاعل 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكنني استخدام محلول تفاعل مختلف للنسخ المختبري باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7؟ ج: لا. صُمم محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 خصيصًا للعمل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7. س: هل يتعرف بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 على نفس تسلسل المحفز الخاص ببوليميراز الحمض النووي الريبي T7 من النوع البري من العاثية؟ ج: نعم. يتعرف كل من بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 وT7 على نفس المحفز: 5′ TAATACGACTCACTATAG 3′، حيث يبدأ النسخ من النيوكليوتيد G. ستكون القاعدة الأولى في النسخة هي G. س: ما هي درجة الحرارة التي يكون عندها بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 نشطًا؟ ج: يكون بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 نشطًا بين 37 درجة مئوية و56 درجة مئوية. عند إجراء تفاعلات النسخ في درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية، يُنصح بتقليل مدة التفاعل إلى 30 دقيقة أو أقل، حيث أن حضانة الحمض النووي الريبي في درجة حرارة عالية لفترات طويلة في وجود كلوريد المغنيسيوم (أحد مكونات محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7) قد يؤدي إلى تحلل الحمض النووي الريبي. س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل عند استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7؟ ج: نقاء قالب الحمض النووي مهم جدًا، ويجب تحضيره باستخدام طرق تنقية مثل عمود الطرد المركزي أو استخلاص الفينول:الكلوروفورم. بالإضافة إلى ذلك، لتجنب تلوث RNase، نوصي بارتداء القفازات واستخدام رؤوس ترشيح وأنابيب خالية من RNase. من المهم خلط مكونات التفاعل جيدًا بعد إذابتها، وإعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب المذكور في البروتوكول للحصول على أفضل النتائج. س: ما هي القوالب التي يمكن استخدامها للنسخ المختبري باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7؟ ج: تشمل قوالب الحمض النووي الريبي ثنائي السلسلة التي يمكن استخدامها مع بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 البلازميدات الخطية، ونواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، أو قليل النوكليوتيدات التكميلية المترابطة التي تحتوي على تسلسل محفز T7. س: هل يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 النسخ من بلازميد غير مقطوع؟ ج: نعم. سيقوم بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 بالنسخ حول القوالب الدائرية عدة مرات دون أن ينفصل. لنسخ حمض نووي ريبي بطول محدد، يمكن خطية البلازميد باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو امتدادًا 5′ أسفل الحمض النووي المطلوب.