نيو إنجلاند بيولابس، M0480L، بوليميراز الحمض النووي OneTaq®

بوليميراز واحد لجميع احتياجاتك في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الفئات ذات الصلة : بوليميرازات الحمض النووي Taq®، تطبيقات بوليميراز الحمض النووي Taq، تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد، تفاعل البوليميراز المتسلسل المتخصص، تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني. المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة ): مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB #N0447)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 15 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية. شروط التفاعل : عبوة واحدة من محلول التفاعل القياسي OneTaq®، 20 ملي مولار Tris-HCl، 22 ملي مولار NH4Cl، 22 ملي مولار KCl، 1.8 ملي مولار MgCl2، 0.06% IGEPAL® CA-630، 0.05% Tween® 20 (الأس الهيدروجيني 8.9 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 1.25 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.5% Tween® 20، 0.5% IGEPAL® CA-630، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا. إكسونوكلياز 5' - 3': نعم. إكسونوكلياز 3' - 5': نعم. إزاحة السلسلة: لا . شروط الفحص: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، و200 ميكرومول من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بما في ذلك [3H]-dTTP، و15 نانومول من الحمض النووي M13 المُهيأ. معدل الخطأ < 140 × 10⁻⁶ قاعدة. الأسئلة الشائعة : س: ما هي نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخاصة بي؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq تسلسل 3'A غير مُستنسخ، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات الحمض النووي الناتجة عن تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. مع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون ذات امتداد 3'A. س: كيف يُمكنني تحديد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يُمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل PCR متدرج. يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المُستخدم. على عكس الآلات الحاسبة الأخرى، تأخذ حاسبة NEB Tm في الاعتبار مكونات المحلول المنظم التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تقلل الآلات الحاسبة الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. لمزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البوليميراز المتسلسل وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تعزز التفاعل المحدد للبادئ مع مكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المختارة. في حين أن درجات حرارة التلدين هي قيم ثابتة يختارها العالم، إلا أن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ والقالب يمكن أن تختلف من منتج تضخيم إلى آخر. ملاحظة: يناقش هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ قليل النوكليوتيدات مع قالب الحمض النووي. خلال مرحلة التمسخ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، تعمل درجة الحرارة العالية على فصل الحمض النووي المزدوج (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، كاشفةً عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتكوين رابطة (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيدي مكمل أحادي السلسلة عند درجة حرارة منخفضة. تُعرف درجة حرارة التمسخ (TA) بأنها درجة الحرارة المستخدمة خلال مرحلة تمسخ البادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل، وتعتمد على درجة انصهار البادئ. درجة انصهار البادئ (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئ بجزيء الحمض النووي المكمل له، بينما يبقى 50% منه حرًا في المحلول نتيجة انفصاله ("انصهاره") عن جزيء الحمض النووي المكمل له. لماذا يُعد استخدام درجة حرارة التمسخ الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التمسخ أقل من درجة انصهار البادئ لضمان تهجينه مع الحمض النووي المكمل. إذا كانت درجة حرارة التمسخ مرتفعة جدًا، فلن يرتبط البادئ بالحمض النووي المكمل ولن تتم عملية التضخيم. إذا كانت درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي بين البادئات والقالب أو بعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب بسبب ظروف التفاعل غير الفعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على درجة انصهار البادئات ودرجة حرارة تلدين التفاعل. لا تُعد درجات الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل PCR، بل تتأثر بعدة عوامل، منها: طول البادئ ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC). يُحدد طول البادئ كمية الروابط الهيدروجينية بين البادئ ومكمله. كلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة الانصهار) بين البادئ والقالب، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئات: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل PCR بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي يجب أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يحدد تركيز أيونات المغنيسيوم الحرة [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة متفاعلات ونواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). ترتبط الشحنة الموجبة للمغنيسيوم بالفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات، والبادئات، والحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). يؤدي انخفاض التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئات وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+). تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: ما هو التركيز النهائي الأمثل للبادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ أ: منتجات البوليميراز تركيز البادئ النهائي الموصى به (لكل منها) نطاق تركيز البادئ النهائي (لكل منها) بوليميراز Q5® 500 نانومتر 200-1000 نانومتر بوليميراز Phusion® 500 نانومتر 200-1000 نانومتر بوليميراز OneTaq® 200 نانومتر 50-1000 نانومتر بوليميراز Taq 200 نانومتر 50-1000 نانومتر Hemo KlenTaq 300 نانومتر 50-1000 نانومتر بوليميراز LongAmp® 400 نانومتر 50-1000 نانومتر نوصي بتركيز نهائي للبادئ يبلغ 500 نانومتر عند استخدام بوليميراز Q5 و Phusion نظرًا لنشاط الإكسونوكلياز العالي 3´-5´. نوصي بتركيز نهائي للبادئات يبلغ 200 نانومتر عند استخدام بوليميرازات Taq، بما في ذلك OneTaq و EpiMark®. يُرجى الرجوع إلى البروتوكولات المحددة في صفحات المنتج للاطلاع على تفاصيل توصيات النطاق. تتميز بوليميرازات عائلة B الأثرية، مثل Q5 و Phusion، بنشاط إكسونوكلياز قوي من 3' إلى 5'، مما قد يؤدي إلى هضم النيوكليوتيدات على الطرف 3' للبادئات وزيادة احتمالية التضخيم غير النوعي. بالمقارنة مع بوليميرازات عائلة A مثل Taq و OneTaq، فإن التركيز النهائي الأعلى للبادئات يتغلب على هذه التأثيرات ويعزز تكوين المنتج النوعي. بشكل عام، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفعال نسبًا مثالية من المغنيسيوم والأيونات الأخرى والبادئات لتعزيز النوعية عن طريق تثبيت الشحنات السالبة على العمود الفقري للفوسفات. على الرغم من أن تركيبة بوليميرازات الحمض النووي Q5 و Phusion هي ملكية خاصة، إلا أن محاليلها المنظمة مُحسَّنة لاستخدام تركيز نهائي للبادئات يبلغ 500 نانومتر. س: ما هي خصائص هذا البوليميراز (الدقة، نهايات المنتج، الحد الأقصى للتضخيم، دمج القاعدة المعدلة، إلخ)؟ أ: دقة منتجات البوليميراز* معدل الخطأ نهايات المنتج أقصى طول للمنتج** درجة حرارة التمديد دمج النيوكليوتيدات المعدلة*** دمج اليوراسيل إكسونوكلياز 5´-3´ 3´-5´ (تدقيق لغوي) إكسونوكلياز بوليميراز Q5 280X <0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC، 6mA لا (باستثناء Q5U) - ++++ بوليميراز فيوجن 39-50X 0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC لا - ++++ بوليميراز ون تاك 2X <140 × 10-6 3´A/blunt 6kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + ++ بوليميراز Taq 1X 2.85 x 10^-4 3´A 5kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2kb 68°C نعم لا - بوليميراز LongAmp® 2X 3´A/blunt 30kb 65°C لا نعم ++ *الدقة نسبةً إلى بوليميراز Taq DNA. نواصل البحث في المقايسات لتوصيف معدل الخطأ المنخفض جدًا لـ Q5 لضمان تقديم بيانات الدقة الأكثر دقةً الممكنة (Potapov, V, and Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **تشمل القوالب البسيطة البلازميدات والفيروسات والحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية. وتشمل القوالب المعقدة الحمض النووي الجينومي للنباتات والبشر والثدييات الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي المكمل (cDNA). *** لمزيد من المعلومات، تواصل مع الدعم الفني عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. لمزيد من المعلومات حول الخصائص التي تساعدك في اختيار بوليميراز مناسب لتطبيقك، يُرجى الاطلاع على مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. تعرّف على المزيد حول الدقة ومعدل الخطأ: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة، بينما يُعرَّف معدل الخطأ بأنه معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. تُعد الدقة مهمة للتطبيقات التي يجب أن يكون فيها تسلسل الحمض النووي صحيحًا بعد التضخيم. لمعرفة المزيد حول كيفية قياس الدقة، انقر هنا. نهايات المنتج ونشاط الإكسونوكلياز: اطّلع على قسم "تعرّف على المزيد" في الأسئلة الشائعة حول نهايات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والأسئلة الشائعة حول نشاط الإكسونوكلياز لبوليميرازات الحمض النووي. س: ما هي متطلبات الاستقرار والتخزين لبوليميرازات الحمض النووي Taq وOneTaq من NEB؟ ج: يجب تخزين منتجات Taq وOneTaq المذكورة أدناه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ومدة صلاحيتها 24 شهرًا: M0267 بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول ThermoPol®، M0270 مزيج Taq الرئيسي 2X، M0271 مزيج Taq الرئيسي سريع التحميل 2X، M0271 مزيج Taq الرئيسي سريع التحميل 2X، M0273 بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول Taq القياسي، M0284 مزيج تفاعل البوليميراز المتعدد 5X الرئيسي، M0285 مزيج Taq الرئيسي 5X، M0320 بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول Taq القياسي (خالٍ من المغنيسيوم)، M0495 بوليميراز الحمض النووي Taq ذو التشغيل الساخن، M0496 مزيج Taq الرئيسي 2X ذو التشغيل الساخن، M0480 بوليميراز الحمض النووي OneTaq®، M0481 بوليميراز الحمض النووي OneTaq® ذو التشغيل الساخن، M0482 مزيج OneTaq® الرئيسي 2X مع المحلول القياسي، M0484 مزيج OneTaq® الرئيسي 2X ذو التشغيل الساخن امزج مع المحلول القياسي M0485، أو مزيج OneTaq® Hot Start 2X الرئيسي مع محلول GC M0486، أو مزيج OneTaq® Quick-Load® 2X الرئيسي مع المحلول القياسي M0488، أو مزيج OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X الرئيسي مع المحلول القياسي M0489، أو مزيج OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X الرئيسي مع محلول GC. س: هل يمكن استخدام بوليميرازات الحمض النووي Taq/OneTaq® لترجمة الشقوق؟ ج: نعم. يمكن استخدام هذا النوع من نشاط الإكسونوكلياز لترجمة الشقوق، وهو أيضًا من خصائص بوليميراز الحمض النووي I (NEB# M0209). س: كيف يمكنني تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عند استخدام بوليميراز الحمض النووي Taq؟ ج: راجع دليل الاستخدام.