نيو إنجلاند بيولابس، M0484S، مزيج OneTaq® Hot Start 2X الرئيسي مع محلول منظم قياسي

الفئات ذات الصلة بـ OneTaq: One، Taq®، بوليميرازات الحمض النووي، Taq، بوليميراز الحمض النووي، الخلطات الرئيسية. التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل بالبدء الساخن، تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع، تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد. المواصفات: تركيبة الخلطة الرئيسية 1X : 20 ملي مولار Tris-HCl، 22 ملي مولار KCl، 22 ملي مولار NH4Cl، 1.8 ملي مولار MgCl2، 5% جلسرين، 0.06% IGEPAL® CA-630، 0.05% Tween® 20، 0.2 ملي مولار dNTPs، 25 وحدة/مل. بوليميراز الحمض النووي OneTaq بالبدء الساخن، درجة الحموضة 8.9 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا. شروط فحص الوحدة : محلول تفاعل ThermoPol® 1X، 200 ميكرومولار dNTPs بما في ذلك [3H]-dTTP و15 نانومولار من الحمض النووي M13 المُهيأ. الأسئلة الشائعة : س: ما هي نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq تسلسل 3'A غير مُستنسخ، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. ومع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون لها نهاية 3'A بارزة. س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart® ومتى يُمكنني استخدامها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير مُحدد. ماذا يعني Hot Start/Warm Start؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® الخاصة بنا أبتاميرات تُثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يُقلل من تكوين نواتج غير مُحددة. لا يُؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين تقنية البدء الساخن وتقنية البدء الدافئ هو أن إنزيمات البدء الساخن محبة للحرارة، بينما إنزيمات البدء الدافئ محبة للحرارة المعتدلة؛ ويتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات المستخدمة في كلتا التقنيتين إلى حد كبير. الأبتاميرات عبارة عن نيوكليوتيدات قليلة مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد من خلال تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النيوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تتمثل ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا تُسمى هذه التقنية "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. سؤال: كيف يمكنني تحديد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج من البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل المتدرج (PCR). يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المستخدم. على عكس الحاسبات الأخرى، تأخذ حاسبة Tm من NEB في الاعتبار مكونات المحلول التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تُقلل الحاسبات الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. لمزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يُرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البلمرة المتسلسل وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البلمرة المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تُعزز التفاعل المحدد للبادئ مع مُكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المُختارة. بينما تُعدّ درجات حرارة التلدين قيمًا ثابتة يختارها العالم، فإن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ وقالب الحمض النووي قد تختلف من مُضخّم لآخر. ملاحظة: يتناول هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ أوليغونوكليوتيد بقالب الحمض النووي. خلال مرحلة التمسخ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، تفصل درجة الحرارة العالية قالب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، كاشفةً عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتلدين (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيد أحادي السلسلة مُكمّل عند درجة حرارة أقل. درجة حرارة التلدين (TA) هي درجة الحرارة المستخدمة خلال مرحلة تلدين البادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل، وهي تعتمد على درجة حرارة انصهار البادئ. درجة حرارة انصهار البادئ (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئ بمُكمّله المثالي، بينما يكون 50% منه حرًا في المحلول نتيجةً لانفصاله ("انصهاره") عن مُكمّله. لماذا يُعدّ استخدام درجة حرارة التلدين الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التلدين أقل من درجة حرارة الانصهار لضمان تهجين البادئ مع القالب. إذا كانت درجة حرارة التلدين مرتفعة جدًا، فلن يرتبط البادئ بالقالب ولن تتم عملية التضخيم. أما إذا كانت منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي للبادئ (أو البادئات) بالقالب أو ببعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب بسبب ظروف التفاعل غير الفعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على درجة حرارة انصهار البادئ ودرجة حرارة التلدين. لا تُعدّ درجات حرارة الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، بل تتأثر بعدد من العوامل، منها: طول البادئ ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC)، والتي تحدد مقدار الروابط الهيدروجينية بين البادئ ومكمله. كلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة انصهار) البادئ مع قالبه، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئ: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي ينبغي أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يُحدد التركيز الحر لأيونات المغنيسيوم [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة المتفاعلات والنواتج في تفاعل البلمرة المتسلسل. ترتبط الشحنة الموجبة للمغنيسيوم بالفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات والبادئات والحمض النووي أحادي السلسلة. يؤدي تقليل التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئ وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز البادئات. تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+): تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: ما هو تركيز البادئ النهائي الأمثل في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ ج: منتجات البوليميراز، تركيز البادئ النهائي الموصى به (لكل منها)، نطاق تركيز البادئ النهائي (لكل منها): بوليميراز Q5®: 500 نانومتر، 200-1000 نانومتر؛ بوليميراز Phusion®: 500 نانومتر، 200-1000 نانومتر؛ بوليميراز OneTaq®: 200 نانومتر، 50-1000 نانومتر؛ بوليميراز Taq: 200 نانومتر، 50-1000 نانومتر؛ Hemo KlenTaq: 300 نانومتر، 50-1000 نانومتر؛ بوليميراز LongAmp®: 400 نانومتر، 50-1000 نانومتر. نوصي بتركيز نهائي للبادئ يبلغ 500 نانومتر عند استخدام بوليميراز Q5 وPhusion نظرًا لنشاطهما العالي في منطقة 3´-5´ من الإكسونوكلياز. نوصي بتركيز نهائي للبادئات يبلغ 200 نانومتر عند استخدام بوليميرازات Taq، بما في ذلك OneTaq و EpiMark®. يُرجى الرجوع إلى البروتوكولات المحددة في صفحات المنتج للاطلاع على تفاصيل توصيات النطاق. تتميز بوليميرازات عائلة B الأثرية، مثل Q5 و Phusion، بنشاط إكسونوكلياز قوي من 3' إلى 5'، مما قد يؤدي إلى هضم النيوكليوتيدات على الطرف 3' للبادئات وزيادة احتمالية التضخيم غير النوعي. بالمقارنة مع بوليميرازات عائلة A مثل Taq و OneTaq، فإن التركيز النهائي الأعلى للبادئات يتغلب على هذه التأثيرات ويعزز تكوين المنتج النوعي. بشكل عام، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفعال نسبًا مثالية من المغنيسيوم والأيونات الأخرى والبادئات لتعزيز النوعية عن طريق تثبيت الشحنات السالبة على العمود الفقري للفوسفات. على الرغم من أن تركيبة بوليميرازات الحمض النووي Q5 و Phusion هي ملكية خاصة، إلا أن محاليلها المنظمة مُحسَّنة لاستخدام تركيز نهائي للبادئات يبلغ 500 نانومتر. س: ما هي خصائص هذا البوليميراز (الدقة، نهايات المنتج، الحد الأقصى للتضخيم، دمج القاعدة المعدلة، إلخ)؟ أ: دقة منتجات البوليميراز* معدل الخطأ نهايات المنتج أقصى طول للمنتج** درجة حرارة التمديد دمج النيوكليوتيدات المعدلة*** دمج اليوراسيل إكسونوكلياز 5´-3´ 3´-5´ (تدقيق لغوي) إكسونوكلياز بوليميراز Q5 280X <0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC، 6mA لا (باستثناء Q5U) - ++++ بوليميراز فيوجن 39-50X 0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC لا - ++++ بوليميراز ون تاك 2X <140 × 10-6 3´A/blunt 6kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + ++ بوليميراز Taq 1X 2.85 x 10^-4 3´A 5kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2kb 68°C نعم لا - بوليميراز LongAmp® 2X 3´A/blunt 30kb 65°C لا نعم ++ *الدقة نسبةً إلى بوليميراز Taq DNA. نواصل البحث في المقايسات لتوصيف معدل الخطأ المنخفض جدًا لـ Q5 لضمان تقديم بيانات الدقة الأكثر دقةً الممكنة (Potapov, V, and Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **تشمل القوالب البسيطة البلازميدات والفيروسات والحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية. وتشمل القوالب المعقدة الحمض النووي الجينومي للنباتات والبشر والثدييات الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي المكمل (cDNA). *** لمزيد من المعلومات، تواصل مع الدعم الفني عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. لمزيد من المعلومات حول الخصائص التي تساعدك في اختيار بوليميراز مناسب لتطبيقك، يُرجى الاطلاع على مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. تعرّف على المزيد حول الدقة ومعدل الخطأ: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة، بينما يُعرَّف معدل الخطأ بأنه معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. تُعد الدقة مهمة للتطبيقات التي يجب أن يكون فيها تسلسل الحمض النووي صحيحًا بعد التضخيم. لمعرفة المزيد حول كيفية قياس الدقة، انقر هنا. نهايات المنتج ونشاط الإكسونوكلياز: اطّلع على قسم "تعرّف على المزيد" في الأسئلة الشائعة حول نهايات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والأسئلة الشائعة حول نشاط الإكسونوكلياز لبوليميرازات الحمض النووي. س: ما هي متطلبات الاستقرار والتخزين لبوليميرازات الحمض النووي Taq وOneTaq من NEB؟ ج: يجب تخزين منتجات Taq وOneTaq المذكورة أدناه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ومدة صلاحيتها 24 شهرًا: M0267 بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول ThermoPol®، M0270 مزيج Taq الرئيسي 2X، M0271 مزيج Taq الرئيسي سريع التحميل 2X، M0271 مزيج Taq الرئيسي سريع التحميل 2X، M0273 بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول Taq القياسي، M0284 مزيج تفاعل البوليميراز المتعدد 5X الرئيسي، M0285 مزيج Taq الرئيسي 5X، M0320 بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول Taq القياسي (خالٍ من المغنيسيوم)، M0495 بوليميراز الحمض النووي Taq ذو التشغيل الساخن، M0496 مزيج Taq الرئيسي 2X ذو التشغيل الساخن، M0480 بوليميراز الحمض النووي OneTaq®، M0481 بوليميراز الحمض النووي OneTaq® ذو التشغيل الساخن، M0482 مزيج OneTaq® الرئيسي 2X مع المحلول القياسي، M0484 مزيج OneTaq® الرئيسي 2X ذو التشغيل الساخن امزج مع المحلول القياسي M0485، أو مزيج OneTaq® Hot Start 2X الرئيسي مع محلول GC M0486، أو مزيج OneTaq® Quick-Load® 2X الرئيسي مع المحلول القياسي M0488، أو مزيج OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X الرئيسي مع المحلول القياسي M0489، أو مزيج OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X الرئيسي مع محلول GC. س: هل يمكن استخدام بوليميرازات الحمض النووي Taq/OneTaq® لترجمة الشقوق؟ ج: نعم. يمكن استخدام هذا النوع من نشاط الإكسونوكلياز لترجمة الشقوق، وهو أيضًا من خصائص بوليميراز الحمض النووي I (NEB# M0209). س: كيف يمكنني تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عند استخدام بوليميراز الحمض النووي Taq؟ ج: راجع دليل الاستخدام.