نيو إنجلاند بيولابس، M0490S، إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq ذو التشغيل الساخن EpiMark®

بوليميراز الحمض النووي مُحسَّن لتحليل علم التخلق. الفئات ذات الصلة: تحليل مثيلة الحمض النووي عن طريق تحويل البيسلفيت، تحليل الميثيلوم، تحليل مثيلة الحمض النووي، التطبيقات : تسلسل البيسلفيت، تفاعل البوليميراز المتسلسل بالبدء الساخن، تفاعل البوليميراز المتسلسل المتخصص، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 15 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية. شروط التفاعل : عبوة واحدة من محلول التفاعل EpiMark® Hot Start Taq Reaction Buffer Pack، 20 ملي مولار Tris-HCl، 1.8 ملي مولار MgCl2، 22 ملي مولار KCl، 0.06% IGEPAL® CA-630، 0.05% Tween® 20، 22 ملي مولار NH4Cl (الأس الهيدروجيني 8.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.5% Tween® 20، 0.5% IGEPAL® CA-630، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: لا. الوزن الجزيئي النظري: 94000 دالتون . إكسونوكلياز 5' - 3': نعم. إكسونوكلياز 3' - 5': لا. الوحدة شروط التحليل: محلول تفاعل ThermoPol® بتركيز 1X، و200 ميكرومول من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بما في ذلك [3H]-dTTP، و15 نانومول من الحمض النووي M13 المُحفَّز. الأسئلة الشائعة : س: ما هي نهايات نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq تسلسل 3'A غير مُستنسخ، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. ومع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون لها نهاية 3'A بارزة. س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart® ومتى يُمكنني استخدامها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير مُحدد. ماذا يعني Hot Start/Warm Start؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® الخاصة بنا أبتاميرات تُثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يُقلل من تكوين نواتج غير مُحددة. لا يُؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين تقنية البدء الساخن وتقنية البدء الدافئ هو أن إنزيمات البدء الساخن محبة للحرارة، بينما إنزيمات البدء الدافئ محبة للحرارة المعتدلة؛ ويتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات المستخدمة في كلتا التقنيتين إلى حد كبير. الأبتاميرات عبارة عن نيوكليوتيدات قليلة مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد من خلال تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النيوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تتمثل ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا تُسمى هذه التقنية "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. سؤال: كيف يمكنني تحديد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج من البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل المتدرج (PCR). يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المستخدم. على عكس الحاسبات الأخرى، تأخذ حاسبة Tm من NEB في الاعتبار مكونات المحلول التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تُقلل الحاسبات الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. لمزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يُرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البلمرة المتسلسل وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البلمرة المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تُعزز التفاعل المحدد للبادئ مع مُكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المُختارة. بينما تُعدّ درجات حرارة التلدين قيمًا ثابتة يختارها العالم، فإن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ وقالب الحمض النووي قد تختلف من مُضخّم لآخر. ملاحظة: يتناول هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ أوليغونوكليوتيد بقالب الحمض النووي. خلال مرحلة التمسخ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، تفصل درجة الحرارة العالية قالب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، كاشفةً عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتلدين (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيد أحادي السلسلة مُكمّل عند درجة حرارة أقل. درجة حرارة التلدين (TA) هي درجة الحرارة المستخدمة خلال مرحلة تلدين البادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل، وهي تعتمد على درجة حرارة انصهار البادئ. درجة حرارة انصهار البادئ (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئ بمُكمّله المثالي، بينما يكون 50% منه حرًا في المحلول نتيجةً لانفصاله ("انصهاره") عن مُكمّله. لماذا يُعدّ استخدام درجة حرارة التلدين الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التلدين أقل من درجة حرارة الانصهار لضمان تهجين البادئ مع القالب. إذا كانت درجة حرارة التلدين مرتفعة جدًا، فلن يرتبط البادئ بالقالب ولن تتم عملية التضخيم. أما إذا كانت منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي للبادئ (أو البادئات) بالقالب أو ببعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب بسبب ظروف التفاعل غير الفعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على درجة حرارة انصهار البادئ ودرجة حرارة التلدين. لا تُعدّ درجات حرارة الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، بل تتأثر بعدد من العوامل، منها: طول البادئ ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC)، والتي تحدد مقدار الروابط الهيدروجينية بين البادئ ومكمله. كلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة انصهار) البادئ مع قالبه، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئ: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي ينبغي أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يُحدد التركيز الحر لأيونات المغنيسيوم [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة المتفاعلات والنواتج في تفاعل البلمرة المتسلسل. ترتبط الشحنة الموجبة للمغنيسيوم بالفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات والبادئات والحمض النووي أحادي السلسلة. يؤدي تقليل التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئ وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز البادئات. تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+): تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: نتائجي ليست كما هو متوقع. أين يمكنني إيجاد مساعدة لحل المشكلة؟ ج: تضخيم غير نوعي، أو عدم حدوث تضخيم، أو حجم المنتج غير صحيح. هل لديك نتيجة غريبة؟ راجع دليلنا لحل مشاكل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بعد انتهاء التفاعل لتحديد الأسباب المحتملة للنتائج غير المتوقعة والحلول. يمكنك الاطلاع على المزيد من التفاصيل حول ظروف التفاعل وتحسين الإعداد في إرشاداتنا لتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة، وفي هذه المدونة. يسعد فريق الدعم الفني دائمًا بالعمل معك لحل مشاكل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة، يمكنك: مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على info@neb.com، أو الاتصال بالدعم الفني على الرقم (800)-0632-7799، متاح من الاثنين إلى الجمعة، من الساعة 9:00 صباحًا حتى 6:00 مساءً بتوقيت شرق الولايات المتحدة، أو ملء هذا النموذج الإلكتروني. فشل تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت: إذا كنت تواجه صعوبة في تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت، فجرب بعض هذه النصائح: نوصي باستخدام بوليميراز Q5® أو Phusion® أو LongAmp®. إذا كنت تستخدم Q5، فحاول تقليل تركيز البادئ النهائي إلى 150-300 نانومتر. تتيح تركيبات الإنزيم والمحلول المنظم المستقلة مرونة أكبر في تحسين التفاعل مقارنةً بالخلطات الرئيسية. استخدم المزيد من القالب. تعامل مع القالب المنقى برفق حتى لا يتلف. حسّن تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زد عدد الدورات. أطل وقت التمديد إلى 40 ثانية/كيلوبايت. التلطيخ على هلام الأغاروز: عند عدم توفر الظروف المثلى لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، غالبًا ما يُلاحظ وجود لطخة أو مستوى عالٍ من الخلفية. جرّب واحدًا أو أكثر من الاقتراحات التالية: استخدم كمية أقل من الإنزيم. خفّض درجة حرارة التمديد بمقدار 3 درجات مئوية عن درجة حرارة التمديد الموصى بها في بروتوكول المنتج المحدد. على سبيل المثال، يوصي بروتوكول OneTaq® بدرجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؛ جرّب 65 درجة مئوية. ارفع درجة حرارة التلدين. جرّب بروتوكولات دورات ثنائية الخطوات. إذا ظهرت هالة مضيئة حول البئر بالإضافة إلى اللطخة من البئر، فاستخدم كمية أقل من القالب. س: ما هو تركيز البادئ النهائي المطلوب في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخاص بي؟ أ: منتجات البوليميراز تركيز البادئ النهائي الموصى به (لكل منها) نطاق تركيز البادئ النهائي (لكل منها) بوليميراز Q5® 500 نانومتر 200-1000 نانومتر بوليميراز Phusion® 500 نانومتر 200-1000 نانومتر بوليميراز OneTaq® 200 نانومتر 50-1000 نانومتر بوليميراز Taq 200 نانومتر 50-1000 نانومتر Hemo KlenTaq 300 نانومتر 50-1000 نانومتر بوليميراز LongAmp® 400 نانومتر 50-1000 نانومتر نوصي بتركيز نهائي للبادئ يبلغ 500 نانومتر عند استخدام بوليميراز Q5 و Phusion نظرًا لنشاط الإكسونوكلياز العالي 3´-5´. نوصي بتركيز نهائي للبادئات يبلغ 200 نانومتر عند استخدام بوليميرازات Taq، بما في ذلك OneTaq و EpiMark®. يُرجى الرجوع إلى البروتوكولات المحددة في صفحات المنتج للاطلاع على تفاصيل توصيات النطاق. تتميز بوليميرازات عائلة B الأثرية، مثل Q5 و Phusion، بنشاط إكسونوكلياز قوي من 3' إلى 5'، مما قد يؤدي إلى هضم النيوكليوتيدات على الطرف 3' للبادئات وزيادة احتمالية التضخيم غير النوعي. بالمقارنة مع بوليميرازات عائلة A مثل Taq و OneTaq، فإن التركيز النهائي الأعلى للبادئات يتغلب على هذه التأثيرات ويعزز تكوين المنتج النوعي. بشكل عام، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفعال نسبًا مثالية من المغنيسيوم والأيونات الأخرى والبادئات لتعزيز النوعية عن طريق تثبيت الشحنات السالبة على العمود الفقري للفوسفات. على الرغم من أن تركيبة بوليميرازات الحمض النووي Q5 و Phusion هي ملكية خاصة، إلا أن محاليلها المنظمة مُحسَّنة لاستخدام تركيز نهائي للبادئات يبلغ 500 نانومتر. س: هل منتج Taq DNA Polymerase هذا متوافق مع محاليل NEB الأخرى؟ أ: اسم المنتج: بوليميراز الحمض النووي Taq ذو البدء الساخن، بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول منظم قياسي، بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول منظم قياسي (خالٍ من المغنيسيوم)، بوليميراز الحمض النووي Taq مع محلول منظم ThermoPol، بوليميراز الحمض النووي Taq ذو البدء الساخن EpiMark®، رقم المنتج: M0495، M0273، M0320، M0267، M0490، المحلول المنظم المرفق: محلول منظم قياسي لتفاعل Taq، محلول منظم قياسي لتفاعل Taq، محلول منظم قياسي لتفاعل Taq (خالٍ من المغنيسيوم)، محلول منظم للتفاعل مع 25 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم، محلول منظم ThermoPol® لتفاعل Taq ذو البدء الساخن EpiMark®، تركيبة المحلول المنظم المرفق بتركيز 1X (التركيز النهائي للتفاعل): 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1.5 ملي مولار MgCl2 (الأس الهيدروجيني 8.3 عند 25 درجة مئوية)، 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1.5 ملي مولار MgCl2، الأس الهيدروجيني 8.3 عند 25 درجة مئوية، 0 محلول منظم متوافق آخر: 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، درجة الحموضة 8.3 عند 25 درجة مئوية؛ 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Triton® X-100، درجة الحموضة 8.8 عند 25 درجة مئوية؛ 20 ملي مولار Tris-HCl، 1.8 ملي مولار MgCl2، 22 ملي مولار KCl، 0.06% IGEPAL® CA-630، 0.05% Tween® 20؛ 22 ملي مولار NH4Cl (درجة الحموضة 8.9 عند 25 درجة مئوية). *لا يُنصح باستخدامه في rCutSmart™ أو محاليل NEBuffers الأخرى*. محلول منظم تفاعل ThermoPol®، محلول منظم تفاعل OneTaq® القياسي، محلول منظم تفاعل LongAmp® Taq®. محلول تفاعل Taq القياسي، محلول تفاعل OneTaq® القياسي، محلول تفاعل LongAmp® Taq، محلول تفاعل Taq القياسي، محلول تفاعل One® القياسي، محلول تفاعل LongAmp® Taq، محلول تفاعل ThermoPol®، محلول تفاعل Taq القياسي. س: ما هي التوصيات العامة لتصميم البادئات للحمض النووي المعالج بالبيسلفيت/المنزوع الأمين؟ ج: نوصي بتصميم بادئات أوليغونوكليوتيدية طويلة (حوالي 26-35) لتضخيم الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت/المنزوع الأمين. نظرًا لأن الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت غالبًا ما يكون تالفًا، فمن الأفضل تصميم أهداف يتراوح طولها بين 150 و500 زوج قاعدي. تجدر الإشارة إلى أنه نظرًا لأن خيوط الحمض النووي لم تعد متكاملة بعد المعالجة بالبيسلفيت/نزع الأمين، فإن مجموعة البادئات الفردية ستضخم خيطًا واحدًا فقط من التسلسل المستهدف. يجب تصميم البادئ الأول ليرتبط بالتسلسل المستهدف المحول. يجب تصميم البادئ الثاني ليرتبط بناتج استطالة البادئ الأول، وليس بسلسلة القالب المقابلة، كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي. يُنصح باستخدام بوادئ ذات درجات حرارة ارتباط أعلى (>60 درجة مئوية، كما هو محدد بواسطة حاسبة NEB Tm) للحصول على أفضل أداء. عند الحاجة، أضف أكبر عدد ممكن من قواعد الغوانين في منطقة البادئ، أو أضف قواعد إضافية لرفع درجة حرارة الانصهار (Tm). كما أن استخدام بوادئ أطول يزيد من الخصوصية. يُفضل تجنب مواقع CpG؛ وإذا لزم الأمر، أضفها إلى الطرف 5′ من البادئ، واحرص على تصنيعها بقاعدة مختلطة (Y = C/T، R = G/A) في موضع السيتوزين. يمكن استخدام برامج حاسوبية مثل MethPrimer أو methBLAST أو BiSearch لتصميم البادئات أو تحليلها. عادةً ما تُلاحظ أفضل النتائج عند استخدام كل بادئ بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكرومولار في التفاعل.