نيو إنجلاند بيولابس، M0492S، مزيج رئيسي عالي الدقة Q5® 2X

Q5 الفئات ذات الصلة: الخلطات الرئيسية، التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى، تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع، تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة ، المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة ): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500)، قالب الحمض النووي والبادئات الأمامية والخلفية المرتبطة به ، التعطيل الحراري: لا، الأسئلة الشائعة: س: ما هي مزايا استخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5®؟ ج: الدقة العالية تعني معدلات خطأ منخفضة، وتسلسلات أكثر دقة. يتميز بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 بمعدل خطأ منخفض للغاية (<1 خطأ لكل مليون قاعدة) نظرًا لنشاط الإكسونوكلياز القوي للتدقيق (3´-5´)، مما يجعله البوليميراز المفضل لجميع تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تتطلب دقة أكبر (دقة تسلسل عالية) أو تضخيم قوالب صعبة (من AT عالي إلى GC عالي). المعالجة العالية تعني مضخمات أطول، وسرعة أكبر. تم دمج بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 مع مجال ربط الحمض النووي Sso7d المعزز للمعالجة، مما يحسن السرعة والدقة والموثوقية في الأداء. تتيح هذه الدقة العالية والقدرة المُحسّنة على المعالجة تضخيمًا أكثر دقةً وأطول للقالب (حتى 10 كيلوبايت من الحمض النووي الجينومي، و20 كيلوبايت من البلازميد). تعرّف على المزيد حول الدقة المُحسّنة: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة. ومن الجوانب الحاسمة للدقة قدرة بوليميراز الحمض النووي على قراءة سلسلة القالب، واختيار نيوكليوسيد ثلاثي الفوسفات المناسب، وإدخال النيوكليوتيد الصحيح في الطرف 3' في المجال التحفيزي للبوليميراز، بحيث يتم الحفاظ على اقتران قواعد واتسون-كريك المتعارف عليه. تتميز البوليميرازات عالية الدقة بتفضيل ارتباط كبير لنيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات الصحيح على غير الصحيح أثناء عملية البلمرة. معدل خطأ البوليميراز هو معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. إذا ارتبط نيوكليوتيد غير صحيح بالموقع النشط للبوليميراز، فإن عملية الإدخال تتباطأ بسبب البنية غير المثلى لمركب الموقع النشط. تتيح هذه الفترة فرصةً لانفصال النيوكليوتيد الخاطئ قبل اندماجه، مما يسمح ببدء العملية من جديد (وارتباط نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات الصحيح). إضافةً إلى التمييز الفعال بين اندماج النيوكليوتيدات الصحيحة والخاطئة في الموقع النشط للبوليميراز، تمتلك بعض بوليميرازات الحمض النووي نشاطًا تصحيحيًا (3´→5´) لإنزيم إكسونيوكلياز. إذا لم يتم اندماج النيوكليوتيد الصحيح بعد فترة، ينتقل الطرف 3´ من سلسلة الحمض النووي المتنامية إلى نطاق الإكسونيوكلياز 3´→5´، حيث تنكسر الرابطة الفوسفودايسترية بين النيوكليوتيد الخاطئ والنيوكليوتيد السابق، مما يؤدي إلى تحرير النيوكليوتيد الخاطئ والسماح للسلسلة بالعودة إلى نطاق البوليميراز، حيث يمكن أن تستمر عملية البلمرة مع النيوكليوتيد الصحيح. تُعدّ الدقة مهمة للتطبيقات التي تتطلب صحة تسلسل الحمض النووي بعد التضخيم، بما في ذلك: الاستنساخ/الاستنساخ الفرعي من مادة مُضخّمة في المختبر (PCR، RCA، إلخ) لدراسات التعبير البروتيني أو الجيني، وتحليل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) عن طريق الاستنساخ والتسلسل، وتحليل الحمض النووي الريبوزي (RNA) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، وتقنيات التسلسل من الجيل التالي. تكون الدقة أقل أهمية في الحالات التالية: إذا تم تسلسل ناتج تضخيم PCR مباشرةً بواسطة تسلسل سانجر (بدون خطوة استنساخ وسيطة)، حيث تكون الإشارة عبارة عن متوسط ​​للمُضخّمات المُدخلة. ومع ذلك، فهي أكثر أهمية لتقنيات التسلسل من الجيل التالي وتقنيات تسلسل الجزيء الواحد. كما أنها مهمة في التطبيقات التشخيصية حيث تكون القراءة هي وجود أو عدم وجود ناتج. يُعزز الدمج مع بروتين Sso7d الرابط للحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) من كفاءة عملية النسخ. كفاءة عملية النسخ هي قدرة البوليميراز على تكرار الحمض النووي دون الانفصال عن القالب، ويتم قياسها بمتوسط ​​عدد النوكليوتيدات المُدمجة لكل حدث ارتباط. يرتبط بروتين Sso7d بالحمض النووي المزدوج، مما يُثبّت بوليميراز الاندماج على القالب، حتى في حال صعوبة الوصول إلى القالب. Sso7d (المستخلص من بكتيريا Sulfolobus solfataricus) هو بروتين رابط للحمض النووي المزدوج، يبلغ وزنه الجزيئي 7 كيلو دالتون، ولا يعتمد على تسلسل الحمض النووي. تسمح بوليميرازات الاندماج مع Sso7d بتقليل أوقات استطالة تفاعل البلمرة المتسلسل (مما يحد من التضخيم غير النوعي)، كما تُتيح استخدام كمية أقل من الإنزيم (مما يُقلل التكلفة، ويُقلل من مكونات محلول التخزين، مثل الجلسرين) عن طريق زيادة كفاءة البوليميراز. على سبيل المثال، يُظهر بوليميراز Pfu (من بكتيريا Pyroccocus furiosis) (وهو بوليميراز من عائلة B الأثرية، مثل Q5®) وحده كفاءة 0.84 مع متوسط ​​طول استطالة البادئ 6 نيوكليوتيدات، بينما يُظهر بروتين الاندماج Pfu-Sso7d كفاءة أعلى، حيث تبلغ كفاءته 0.98 مع متوسط ​​طول استطالة 55 نيوكليوتيدًا (3). (1) جونسون، ك. أ. (2010) بيوشيميكا إت بيوفيزيكا أكتا، 1804، 1041-1048. PMID: 20079883 (2) جويس، س. م.، وبينكوفيتش، س. ج. (2004) بيوكيمستري، 43، 14317-14324. PMID: 15533035 (3) وانغ، ي. وآخرون (2004) نيوكليك أسيدز ريس، 32، 1197-1207. PMID: 14973201 س: ما هي الاختلافات بين منتجات بوليميراز Q5® العديدة المتوفرة؟ ج: يوصى باستخدام تركيبات الإنزيم المستقلة (NEB #M0491، #M0493) لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل المرن وللقوالب ذات المحتوى العالي من GC (عن طريق إضافة مُحسِّن المحتوى العالي من GC إلى التفاعل). توفر تركيبات المزيج الرئيسي (NEB #M0492، #M0494) أقصى درجات الراحة لاحتوائها على الإنزيم، وأيونات المغنيسيوم (Mg2+)، والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، وجميع مكونات المحلول المنظم اللازمة لدعم تضخيم قوي - لا يلزم سوى إضافة القالب والبادئات. تعمل تركيبات البدء الساخن (NEB #M0493، #M0494) على تثبيط نشاط الإنزيم، مما يسمح بإعداد التفاعل بسهولة في درجة حرارة الغرفة، وهي مناسبة لجميع تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي تتطلب دقة أعلى، أو خصوصية عالية، أو تضخيم أهداف صعبة أو طويلة. لمزيد من المعلومات حول تقنية البدء الساخن، انقر هنا. تم تحسين تركيبات NEBNext® Q5 (NEB #M0541، #M0543، #M0544) خصيصًا للحد من تحيز GC أثناء تضخيم مكتبات التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS). يُعد M0544 المزيج الرئيسي المقترح لتطبيقات NGS. تم تصميم مزيج Q5 Blood Direct 2X الرئيسي (NEB #M0500) خصيصًا لعينات الدم دون الحاجة إلى خطوة تنقية. إنه إنزيم بدء ساخن. لا يستطيع بوليميراز Q5 قراءة اليوراسيل أو دمجه، بينما يستطيع بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U® Hot Start (NEB #M0515) ذلك. استخدمه مع قوالب الحمض النووي التي تحتوي على اليوراسيل، أو المحولة بالبيسلفيت، أو منزوعة الأمين، أو التالفة. يمكن استخدام Q5U وdUTP/dTTP لمنع التلوث المتبقي. إنه إنزيم بدء ساخن. س: نتائجي ليست كما هو متوقع. أين يمكنني العثور على مساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟ ج: تضخيم غير محدد، أو عدم وجود تضخيم، أو حجم منتج خاطئ. هل لديك نتيجة غريبة؟ راجع دليل استكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وإصلاحها بعد تفاعلك لتحديد الأسباب المحتملة للنتائج غير المتوقعة والحلول. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول ظروف التفاعل وتحسين الإعداد في إرشاداتنا لتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة وفي منشور المدونة هذا. يسعد فريق الدعم الفني دائمًا بالعمل معك لاستكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل وإصلاحها. إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة، يمكنك: مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على info@neb.com، أو الاتصال بالدعم الفني على الرقم (800)-0632-7799، متاح من الاثنين إلى الجمعة، من الساعة 9:00 صباحًا حتى 6:00 مساءً بتوقيت شرق الولايات المتحدة، أو ملء هذا النموذج الإلكتروني. فشل تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت: إذا كنت تواجه صعوبة في تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت، فجرب بعض هذه النصائح: نوصي باستخدام بوليميراز Q5® أو Phusion® أو LongAmp®. إذا كنت تستخدم Q5، فحاول تقليل تركيز البادئ النهائي إلى 150-300 نانومتر. تتيح تركيبات الإنزيم والمحلول المنظم المستقلة مرونة أكبر في تحسين التفاعل مقارنةً بالخلطات الرئيسية. استخدم المزيد من القالب. تعامل مع القالب المنقى برفق حتى لا يتلف. حسّن تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زد عدد الدورات. أطل وقت التمديد إلى 40 ثانية/كيلوبايت. التلطيخ على هلام الأغاروز: عند عدم توفر الظروف المثلى لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، غالبًا ما يُلاحظ وجود لطخة أو مستوى عالٍ من الخلفية. جرّب واحدًا أو أكثر من الاقتراحات التالية: استخدم كمية أقل من الإنزيم. خفّض درجة حرارة التمديد بمقدار 3 درجات مئوية عن درجة حرارة التمديد الموصى بها في بروتوكول المنتج المحدد. على سبيل المثال، يوصي بروتوكول OneTaq® بدرجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؛ جرّب 65 درجة مئوية. ارفع درجة حرارة التلدين. جرّب بروتوكولات دورات ثنائية الخطوات. إذا ظهرت هالة مضيئة حول البئر بالإضافة إلى اللطخة من البئر، فاستخدم كمية أقل من القالب. س: ما هي نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq قاعدة 3'A غير مُرتبطة بالقالب، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. ومع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون لها قاعدة 3'A بارزة. س: ما معنى نشاط الإكسونوكلياز بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي؟ ج: يمكن أن تمتلك البوليميرازات نوعين من نشاط الإكسونوكلياز: نشاط الإكسونوكلياز 5'–3' الذي يهضم النيوكليوتيدات في الاتجاه من 5' إلى 3' على القالب قبل نشاط البوليميراز. يمتلك إنزيم بوليميراز Taq نوعًا محددًا من نشاط الإكسونوكلياز 5'-3' يُسمى نشاط إندونوكلياز الطرف 5'، والذي يحفز قطع أطراف الحمض النووي 5' من جزيء DNA مزدوج يحتوي على طرف 5' متدلٍّ أحادي السلسلة على أحد خيوطه. أما نشاط الإكسونوكلياز 3'-5'، المعروف أيضًا بنشاط التدقيق، فيقوم بهضم النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعات هيدروكسيل 3' من الاتجاه 3' إلى 5'. ويشمل ذلك تصحيح أزواج القواعد غير المتطابقة والهضم الطرفي 3'. تمتلك بعض إنزيمات البوليميراز أحد هذين النوعين من نشاط الإكسونوكلياز أو كليهما. في وجود dNTPs، يكون نشاط البلمرة أعلى من نشاط الإكسونوكلياز. بينما لا تمتلك بعض إنزيمات البوليميراز أيًا من هذين النشاطين. للمزيد من المعلومات، ما معنى امتلاك إنزيم بوليميراز لنشاط الإكسونوكلياز 5'-3'؟ عندما تصادف بوليميرازات ذات نشاط إكسونوكلياز 5´-3´ نيوكليوتيدًا في اتجاه 3' على نفس السلسلة، تتحلل روابط الفوسفودايستر في السلسلة المصادفة (تُهضم) قبل بدء عملية البلمرة. يمتلك بوليميراز Taq نوعًا محددًا من نشاط الإكسونوكلياز 5´-3´ يُسمى نشاط إندونوكلياز 5´ flap، والذي يحفز انقسام زوائد الحمض النووي 5´ من جزيء DNA مزدوج يحتوي على نتوء أحادي السلسلة 5' على إحدى السلسلتين. عندما يصادف بوليميراز Taq بنية زوائد كهذه، مثل الفلوروفور الموجود على مسبار التحلل المائي في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)، فإنه يهضم روابط الفوسفودايستر بين النيوكليوتيدات في اتجاه 5´-3´ بشكل متسلسل قبل بدء عملية البلمرة. يوضح الشكل العلاقة بين نشاط الإكسونوكلياز 3´-5´ (التدقيق) وطول ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تضمن بوليميرازات الحمض النووي دقة التضاعف باستخدام سلسلة من نقاط التفتيش الجزيئية في موقع إدخال النيوكليوتيدات وما بعده. أثناء إضافة النيوكليوتيدات، يتم وضع النيوكليوتيد الصحيح الداخل في موضع مناسب لمحاذاة فعالة للمجموعات التحفيزية، مما يضمن إدخاله بكفاءة. هذه المحاذاة التحفيزية حساسة للتشوهات في الموضع الناتجة عن اقتران قواعد واتسون-كريك غير الصحيح، مما يسمح بتوقف حركي عند أزواج القواعد غير الصحيحة أو غير المتوافقة. تتحقق البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق من إدخال النيوكليوتيد الصحيح في القالب. في حالة اكتشاف عدم تطابق، يُنقل الحمض النووي من نطاق البلمرة إلى نطاق الإكسونوكلياز الطرفي 3' - 5' للبوليميراز. يُستأصل النيوكليوتيد المُدخل بشكل غير صحيح، ويعود الحمض النووي إلى نطاق البلمرة، ويمكن استئناف النسخ. قد يكون لغياب نشاط الإكسونوكلياز 3' - 5' (التدقيق) تداعيات أخرى غير دقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يُعتقد أن افتقار إنزيم Taq DNA بوليميراز لخاصية التدقيق اللغوي يحد من أقصى حجم ممكن للمنتج المُضخّم. عمومًا، يُظهر إنزيم Taq أفضل أداء له عند تضخيم قطع الحمض النووي التي يقل طولها عن 2 كيلوبايت، ولكنه قادر على العمل مع قطع يصل طولها إلى 3-4 كيلوبايت. عند الالتزام بهذا الحجم للمنتج المُضخّم، يُعدّ Taq إنزيمًا قويًا وسهل التحسين. مع ذلك، تنخفض فعاليته بسرعة مع المنتجات التي يزيد طولها عن 3 كيلوبايت تقريبًا. أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، يُدخل إنزيم Taq نيوكليوتيدات خاطئة ويُنتج عدم تطابق، مما يجعله عرضةً للتوقف، ويزيد من احتمالية انفصاله قبل استكمال المنتج كامل الطول. قد يؤدي اجتماع حجم مُضخّم مُعين ومعدل خطأ البوليميراز إلى تراكم عدد كافٍ من النهايات غير المتطابقة في الطرف 3'، مما يُعيق عملية تفاعل البلمرة المتسلسل بشكل فعال. تُشكّل هذه النهايات غير المتطابقة في الطرف 3' مشكلةً خاصةً لإنزيم Taq لأنه يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'→ 5' لإزالتها. بإضافة كمية صغيرة من بوليميراز ذي نشاط إكسونوكلياز مصحح، مثل بوليميراز الحمض النووي Deep Vent®، يمكن تضخيم قطع الحمض النووي التي يبلغ طولها 20 كيلوبايت أو أكثر (انظر بوليميراز الحمض النووي LongAmp®). وبما أن الغالبية العظمى من الإنزيم في المزيج هي بوليميراز الحمض النووي Taq، فمن المرجح أنه يقوم بمعظم عملية إطالة البادئ، بينما يقوم بوليميراز الحمض النووي Deep Vent المصحح بإزالة عدم التطابق 3' المثبط الناتج عن Taq. لمعرفة المزيد عن بنية البوليميراز وكيفية ارتباط البنية بالوظيفة، راجع هذه المقالة. كيف يمكن تثبيط نشاط الإكسونوكلياز أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ أضف روابط فوسفوروثيوات إلى البادئات. رابطة الفوسفوروثيوات (pt) هي رابطة فوسفودايستر حيث تم استبدال إحدى ذرتي الأكسجين غير الجسريتين بذرة كبريت، مما يثبط نشاط الفوسفودايستراز. كيميائيًا، لا يُغير استبدال الأكسجين بالكبريت بشكلٍ كبير من تفاعلية الرابطة، وتظل عديدات النوكليوتيدات المحتوية على π قادرة على العمل في العديد من التفاعلات الإنزيمية. في معظم الحالات، تكفي 2-3 روابط π عند الطرف 3' لحجب نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' لإنزيم البوليميراز. س: ما هي خصائص هذا البوليميراز (الدقة، نهايات الناتج، أقصى حجم مُضخّم، دمج القواعد المُعدّلة، إلخ)؟ أ: دقة منتجات البوليميراز* معدل الخطأ نهايات المنتج أقصى طول للمنتج** درجة حرارة التمديد دمج النيوكليوتيدات المعدلة*** دمج اليوراسيل إكسونوكلياز 5´-3´ 3´-5´ (تدقيق لغوي) إكسونوكلياز بوليميراز Q5 280X <0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC، 6mA لا (باستثناء Q5U) - ++++ بوليميراز فيوجن 39-50X 0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC لا - ++++ بوليميراز ون تاك 2X <140 × 10-6 3´A/blunt 6kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + ++ بوليميراز Taq 1X 2.85 x 10^-4 3´A 5kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2kb 68°C نعم لا - بوليميراز LongAmp® 2X 3´A/blunt 30kb 65°C لا نعم ++ *الدقة نسبةً إلى بوليميراز Taq DNA. نواصل البحث في المقايسات لتوصيف معدل الخطأ المنخفض جدًا لـ Q5 لضمان تقديم بيانات الدقة الأكثر دقةً الممكنة (Potapov, V, and Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **تشمل القوالب البسيطة البلازميدات والفيروسات والحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية. وتشمل القوالب المعقدة الحمض النووي الجينومي للنباتات والبشر والثدييات الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي المكمل (cDNA). *** لمزيد من المعلومات، تواصل مع الدعم الفني عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. لمزيد من المعلومات حول الخصائص التي تساعدك في اختيار بوليميراز مناسب لتطبيقك، يُرجى الاطلاع على مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. تعرّف على المزيد حول الدقة ومعدل الخطأ: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة، بينما يُعرَّف معدل الخطأ بأنه معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. تُعد الدقة مهمة للتطبيقات التي يجب أن يكون فيها تسلسل الحمض النووي صحيحًا بعد التضخيم. لمعرفة المزيد حول كيفية قياس الدقة، انقر هنا. نهايات المنتج ونشاط الإكسونوكلياز: اطّلع على قسم "تعرّف على المزيد" في الأسئلة الشائعة حول نهايات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والأسئلة الشائعة حول نشاط الإكسونوكلياز لبوليميرازات الحمض النووي. سؤال: هل يُظهر بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® نشاط إزاحة السلسلة؟ ج: لا. يتميز بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 (وجميع تركيبات منتجات Q5) بميل ضعيف للغاية لإزاحة النيوكليوتيدات الموجودة في اتجاه المصب على السلسلة غير القالبية. للاطلاع على المزيد من خصائص بوليميرازاتنا، راجع مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. س: كيف أحدد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل المتدرج (PCR). يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المستخدم. على عكس الحاسبات الأخرى، تأخذ حاسبة Tm من NEB في الاعتبار مكونات المحلول التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تقلل الحاسبات الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. للحصول على مزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يُرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تُعزز التفاعل النوعي للبادئ مع مُكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المُختارة. بينما تُعد درجات حرارة التلدين قيمًا ثابتة يختارها الباحث، إلا أن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ والقالب قد تختلف من مُنتج تضخيم إلى آخر. ملاحظة: يتناول هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ أوليغونوكليوتيد مع قالب الحمض النووي. خلال خطوة التمسخ في تفاعل البوليميراز المتسلسل، تعمل درجة الحرارة العالية على فصل قالب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، مما يكشف عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتلدين (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيد أحادي السلسلة مُكمل عند درجة حرارة أقل. درجة حرارة التلدين (TA) هي درجة الحرارة المستخدمة خلال خطوة تلدين البادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وتعتمد على درجة حرارة انصهار البادئات. درجة حرارة انصهار البادئة (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئة بمكملها المثالي، بينما يبقى 50% منها حرًا في المحلول نتيجة انفصاله ("انصهاره") عن مكمله. لماذا يُعد استخدام درجة حرارة التلدين الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التلدين أقل من درجة حرارة الانصهار لضمان تهجين البادئات مع القالب. إذا كانت درجة حرارة التلدين مرتفعة جدًا، فلن ترتبط البادئة بالقالب ولن تتم عملية التضخيم. أما إذا كانت درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي للبادئة (أو البادئات) بالقالب أو ببعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب نتيجة لظروف تفاعل غير فعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على درجة انصهار البادئات ودرجة حرارة التلدين. لا تُعدّ درجات الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل PCR، بل تتأثر بعدة عوامل، منها: طول البادئات ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC). يحدد طول البادئات مقدار الروابط الهيدروجينية بين البادئة ومكملها. فكلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة الانصهار) بين البادئة والقالب، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئات: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل PCR بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي ينبغي أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يحدد التركيز الحر لأيونات المغنيسيوم [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة متفاعلات ونواتج تفاعل PCR. تعمل الشحنة الموجبة للمغنيسيوم على استخلاب الفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات والبادئات والحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). يؤدي تقليل التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئ وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+) في البادئ. تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: ما هو التركيز النهائي الأمثل للبادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ أ: منتجات البوليميراز تركيز البادئ النهائي الموصى به (لكل منها) نطاق تركيز البادئ النهائي (لكل منها) بوليميراز Q5® 500 نانومتر 200-1000 نانومتر بوليميراز Phusion® 500 نانومتر 200-1000 نانومتر بوليميراز OneTaq® 200 نانومتر 50-1000 نانومتر بوليميراز Taq 200 نانومتر 50-1000 نانومتر Hemo KlenTaq 300 نانومتر 50-1000 نانومتر بوليميراز LongAmp® 400 نانومتر 50-1000 نانومتر نوصي بتركيز نهائي للبادئ يبلغ 500 نانومتر عند استخدام بوليميراز Q5 و Phusion نظرًا لنشاط الإكسونوكلياز العالي 3´-5´. نوصي بتركيز نهائي للبادئات يبلغ 200 نانومتر عند استخدام بوليميرازات Taq، بما في ذلك OneTaq و EpiMark®. يُرجى الرجوع إلى البروتوكولات المحددة في صفحات المنتج للاطلاع على تفاصيل توصيات النطاق. تتميز بوليميرازات عائلة B الأثرية، مثل Q5 و Phusion، بنشاط إكسونوكلياز قوي من 3' إلى 5'، مما قد يؤدي إلى هضم النيوكليوتيدات على الطرف 3' للبادئات وزيادة احتمالية التضخيم غير النوعي. بالمقارنة مع بوليميرازات عائلة A مثل Taq و OneTaq، فإن التركيز النهائي الأعلى للبادئات يتغلب على هذه التأثيرات ويعزز تكوين المنتج النوعي. بشكل عام، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفعال نسبًا مثالية من المغنيسيوم والأيونات الأخرى والبادئات لتعزيز النوعية عن طريق تثبيت الشحنات السالبة على العمود الفقري للفوسفات. على الرغم من أن تركيبة بوليميرازات الحمض النووي Q5 و Phusion هي ملكية خاصة، إلا أن محاليلها المنظمة مُحسَّنة لاستخدام تركيز نهائي للبادئات يبلغ 500 نانومتر. س: متى وكيف يجب عليّ استخدام مُحسِّن Q5® عالي GC؟ ج: مُحسِّن Q5 عالي المحتوى GC هو مُضاف يُنصح باستخدامه عند التعامل مع قوالب صعبة أو ذات محتوى GC عالٍ، ولكنه قد يُثبِّط التفاعل عند استخدام قوالب ذات محتوى AT عالٍ. يُمكن لإنزيم Q5 المُستقل تغطية نطاق أوسع من محتوى GC (يصل إلى 80%) بإضافة مُحسِّن GC. مُحسِّن Q5 عالي المحتوى GC هو كاشف مُكمِّل لإنزيم Q5 وتركيبات المُنظِّم (M0491 وM0493) ولا يُنصح باستخدامه بمفرده. *هذا المُحسِّن ليس مُنظِّمًا مُستقلًا ولا يُنصح باستخدامه بمفرده. بالإضافة إلى ذلك، لا يُنصح بإضافته إلى أي من مُخاليط Q5 الرئيسية (M0492، M0494، M0500، E0555). لا يستفيد Q5U من مُحسِّن Q5 عالي المحتوى GC، ولا نُوصي باستخدامه. قد تُحسِّن إضافة مُضافات PCR الشائعة، مثل DMSO بنسبة تصل إلى 2%، تضخيم بعض الأهداف الصعبة أو الطويلة. غالبًا لا داعي لتغيير درجة حرارة التلدين لتفاعلك بعد إضافة مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من GC. نوصي باستخدام حاسبة Tm الخاصة بنا لتحديد درجة حرارة التلدين لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). يُقلل استخدام مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من GC عادةً من النطاق الفعال لدرجات الحرارة التي يُمكن عندها ملاحظة التضخيم النوعي عن طريق تقليل البنى الثانوية المعقدة للقالب، مما قد يزيد من تضخيم الحمض النووي المستهدف ويُحسِّن من إنتاجية المنتجات التي يصعب تضخيمها، مثل القوالب الغنية بـ GC. بشكل عام، تعمل إضافات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عادةً بإحدى طريقتين: الأولى، عن طريق تقليل البنى الثانوية للحمض النووي، وبالتالي زيادة تضخيم الحمض النووي المستهدف. يمكن أن تُزعزع الإضافات التي ترتبط بالأخاديد الصغرى والكبرى للحمض النووي استقرار البنى الثانوية للحمض النووي، مما يؤثر على الروابط الهيدروجينية للثنائي. تشمل البنى الثانوية الحلزون المزدوج (زيادة الروابط الهيدروجينية بسبب زيادة محتوى GC) وبنى الحلقة الجذعية (دبابيس الشعر أو النيوكليوتيدات المنتفخة التي تُقلل من التهجين). أما الطريقة الثانية، فهي عن طريق تقليل التمهيد غير النوعي، وبالتالي تقليل تضخيم الحمض النووي خارج الهدف. س: يوجد راسب في قاع أنبوب المحلول المنظم. هل هذا طبيعي؟ ج: قد يترسب محلول التفاعل Q5® عند تجميده وإذابته. هذا لا يدل على وجود مشكلة في المنتج. للحصول على أفضل النتائج، قم بإذابة المنتج تمامًا، ثم أعد تعليق أي راسب عن طريق تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة وقلبه برفق حتى يذوب تمامًا. س: يوجد راسب في قاع أنبوب المزيج الرئيسي. هل هذا طبيعي؟ ج: قد يترسب المزيج الرئيسي Q5® عند تجميده وإذابته. هذا لا يدل على وجود مشكلة في المنتج. للحصول على أفضل النتائج، قم بإذابة المنتج تمامًا، ثم أعد تعليق أي راسب عن طريق تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة وقلبه برفق حتى يذوب تمامًا.