نيو إنجلاند بيولابس، M0500L، كيو 5® بلود دايركت 2X ماستر ميكس

الفئات ذات الصلة: الخلطات الرئيسية، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، وتقنيات التضخيم. التطبيقات : تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون استخلاص، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي ثنائي الخطوات. المواصفات : التعطيل الحراري: لا. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين Q5® Blood Direct 2X Master Mix وHemo KlenTaq (NEB #M0332)؟ ج: Hemo KlenTaq هو بوليميراز مباشر للدم يعتمد على بوليميراز Taq DNA متحور، بينما يحتوي Q5 Blood Direct 2X Master Mix على بوليميراز Q5 Hot Start عالي الدقة. يأتي Q5 Blood Direct 2X Master Mix كمزيج يحتوي على محلول منظم وdNTPs بالإضافة إلى الإنزيم. أما Hemo KlenTaq فهو إنزيم مستقل مع محلول منظم تفاعل منفصل بتركيز 5X لا يحتوي على dNTPs. يُنصح باستخدام Q5 Blood Direct 2X Master Mix في التطبيقات التي تتطلب دقة أعلى، مثل استخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في تطبيقات لاحقة. يستطيع إنزيم Q5 Blood تضخيم أجزاء من الدم البشري يصل طولها إلى 7.5 كيلوبايت، بينما لا يستطيع إنزيم Hemo KlenTaq تضخيم أجزاء أطول من 2 كيلوبايت. س: ما أنواع العينات/المواد المتوافقة مع مزيج Q5® Blood Direct 2X Master Mix؟ ج: تم تقييم هذه المجموعة باستخدام ما يصل إلى 40% (حجم/حجم) من الدم البشري الكامل المحفوظ بمضادات التخثر Na EDTA وK2 EDTA وسترات الصوديوم وهيبارين الصوديوم. مع ذلك، نقترح البدء بنسبة 5-10% (حجم/حجم) من الدم. كما تم اختبار المزيج الرئيسي باستخدام عينات من الدم البشري المجفف على ورق Whatman® 903 وورق FTA. نوصي بالبدء بعينة واحدة قطرها 0.5 مم في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر، أو بعينة واحدة قطرها 1 مم في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر. س: ما تركيز الدم الكامل الموصى به للاستخدام مع مزيج Q5® Blood Direct 2X Master Mix؟ ج: يُوصى باستخدام تركيز دم كامل بنسبة 5-10% (حجم/حجم) كبداية لمزيج Q5 Blood Direct 2X Master Mix. من الممكن استخدام دم بنسبة تصل إلى 40%، ولكن قد يلزم تعديل ظروف التفاعل. بالنسبة لأحجام الدم الأكبر (≥ 20%)، يُوصى باستخدام حجم تفاعل 50 ميكرولتر نظرًا لصعوبة استخلاص الطور المائي من بقايا خلايا الدم المتبقية بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). س: ما هي مضادات تخثر الدم التي يمكن استخدامها مع مزيج Q5® Blood Direct 2X Master Mix؟ ج: مضادات التخثر K2 EDTA وNa EDTA وسترات الصوديوم وهيبارين الصوديوم جميعها متوافقة مع مزيج Q5 Blood Direct 2X Master Mix. س: كيف أقوم بمعالجة عينات الدم المجففة مسبقًا؟ ج: المعالجة المسبقة غير ضرورية عمومًا لعينة واحدة بحجم 0.5 مم في تفاعل 20 ميكرولتر أو عينة واحدة بحجم 1 مم في تفاعل 50 ميكرولتر. مع ذلك، عند استخدام عدد أكبر من الثقوب أو أحجامها، يمكن معالجتها مسبقًا لتجنب أي تثبيط محتمل لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). للمعالجة المسبقة، ضع ثقبًا واحدًا في أنبوب تفاعل البلمرة المتسلسل. أضف 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز، وسخّنه إلى 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أزل السائل الطافي باستخدام طرف ماصة، واستخدم الثقب المغسول في تفاعل البلمرة المتسلسل. س: ما هو طول المنتج الذي يمكن إنتاجه باستخدام مزيج Q5® Blood Direct 2X Master Mix؟ ج: من خلايا الدم البشرية، قمنا بتضخيم منتجات يصل طولها إلى 7.5 كيلوبايت. س: ما هي نهايات منتجات تفاعل البلمرة المتسلسل؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq تسلسل 3'A غير مُستنسخ، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. ومع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون لها نهاية 3'A بارزة. س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart® ومتى يُمكنني استخدامها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير مُحدد. ماذا يعني Hot Start/Warm Start؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® الخاصة بنا أبتاميرات تُثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يُقلل من تكوين نواتج غير مُحددة. لا يُؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين تقنية البدء الساخن وتقنية البدء الدافئ هو أن إنزيمات البدء الساخن محبة للحرارة، بينما إنزيمات البدء الدافئ محبة للحرارة المعتدلة؛ ويتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات المستخدمة في كلتا التقنيتين إلى حد كبير. الأبتاميرات عبارة عن نيوكليوتيدات قليلة مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد من خلال تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النيوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تتمثل ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا تُسمى هذه التقنية "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. س: ما هي خصائص هذا البوليميراز (الدقة، نهايات المنتج، الحد الأقصى للتضخيم، دمج القواعد المعدلة، إلخ)؟ أ: دقة منتجات البوليميراز* معدل الخطأ نهايات المنتج أقصى طول للمنتج** درجة حرارة التمديد دمج النيوكليوتيدات المعدلة*** دمج اليوراسيل إكسونوكلياز 5´-3´ 3´-5´ (تدقيق لغوي) إكسونوكلياز بوليميراز Q5 280X <0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC، 6mA لا (باستثناء Q5U) - ++++ بوليميراز فيوجن 39-50X 0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC لا - ++++ بوليميراز ون تاك 2X <140 × 10-6 3´A/blunt 6kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + ++ بوليميراز Taq 1X 2.85 x 10^-4 3´A 5kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2kb 68°C نعم لا - بوليميراز LongAmp® 2X 3´A/blunt 30kb 65°C لا نعم ++ *الدقة نسبةً إلى بوليميراز Taq DNA. نواصل البحث في المقايسات لتوصيف معدل الخطأ المنخفض جدًا لـ Q5 لضمان تقديم بيانات الدقة الأكثر دقةً الممكنة (Potapov, V, and Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **تشمل القوالب البسيطة البلازميدات والفيروسات والحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية. وتشمل القوالب المعقدة الحمض النووي الجينومي للنباتات والبشر والثدييات الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي المكمل (cDNA). *** لمزيد من المعلومات، تواصل مع الدعم الفني عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. لمزيد من المعلومات حول الخصائص التي تساعدك في اختيار بوليميراز مناسب لتطبيقك، يُرجى الاطلاع على مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. تعرّف على المزيد حول الدقة ومعدل الخطأ: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة، بينما يُعرَّف معدل الخطأ بأنه معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. تُعد الدقة مهمة للتطبيقات التي يجب أن يكون فيها تسلسل الحمض النووي صحيحًا بعد التضخيم. لمعرفة المزيد حول كيفية قياس الدقة، انقر هنا. نهايات المنتج ونشاط الإكسونوكلياز: اطّلع على قسم "تعرّف على المزيد" في الأسئلة الشائعة حول نهايات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والأسئلة الشائعة حول نشاط الإكسونوكلياز لبوليميرازات الحمض النووي. س: نتائجي ليست كما هو متوقع. أين يمكنني العثور على مساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟ أ: تضخيم غير نوعي، أو عدم حدوث تضخيم، أو حجم ناتج غير صحيح. هل لديك نتيجة غير متوقعة؟ راجع دليل استكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وإصلاحها بعد انتهاء التفاعل لتحديد الأسباب المحتملة للنتائج غير المتوقعة والحلول. يمكنك الاطلاع على المزيد من التفاصيل حول ظروف التفاعل وتحسين الإعداد في إرشاداتنا لتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة، وفي هذه المدونة. يسعد فريق الدعم الفني دائمًا بمساعدتك في استكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل وإصلاحها. إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة، يمكنك: مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على info@neb.com، أو الاتصال بالدعم الفني على الرقم (800)-0632-7799، متاح من الاثنين إلى الجمعة، من الساعة 9:00 صباحًا حتى 6:00 مساءً بتوقيت شرق الولايات المتحدة، أو ملء هذا النموذج الإلكتروني. فشل تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت: إذا كنت تواجه صعوبة في تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت، فجرب بعض هذه النصائح: نوصي باستخدام بوليميراز Q5® أو Phusion® أو LongAmp®. إذا كنت تستخدم Q5، فحاول تقليل تركيز البادئ النهائي إلى 150-300 نانومتر. تتيح تركيبات الإنزيم والمحلول المنظم المستقلة مرونة أكبر في تحسين التفاعل مقارنةً بالخلطات الرئيسية. استخدم المزيد من القالب. تعامل مع القالب المنقى برفق حتى لا يتلف. حسّن تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زد عدد الدورات. أطل وقت التمديد إلى 40 ثانية/كيلوبايت. التلطيخ على هلام الأغاروز: عند عدم توفر الظروف المثلى لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، غالبًا ما تُلاحظ لطخة أو مستوى عالٍ من الخلفية. جرّب واحدًا أو أكثر من الاقتراحات التالية: استخدم كمية أقل من الإنزيم، خفّض درجة حرارة التمديد بمقدار 3 درجات مئوية عن درجة حرارة التمديد الموصى بها في بروتوكول المنتج المحدد. على سبيل المثال، يوصي بروتوكول OneTaq® بدرجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؛ جرّب 65 درجة مئوية. ارفع درجة حرارة التلدين. جرّب بروتوكولات دورات ثنائية الخطوات. إذا كانت هناك هالة مضيئة حول البئر بالإضافة إلى اللطخة من البئر، فاستخدم كمية أقل من القالب. س: متى وكيف يجب عليّ استخدام مُحسِّن Q5® عالي المحتوى من GC؟ ج: مُحسِّن Q5® عالي المحتوى من GC هو مُضاف يُنصح باستخدامه عند التعامل مع قوالب صعبة أو ذات محتوى GC عالٍ، ولكنه قد يكون مُثبِّطًا عند استخدام قوالب ذات محتوى AT عالٍ. يمكن لإنزيم Q5 المُستقل تغطية نطاق أوسع من محتوى GC (يصل إلى 80%) مع إضافة مُحسِّن GC. مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من الجوانين والسيتوزين هو مُكمِّل لتركيبات إنزيم Q5 والمحاليل المنظمة (M0491 وM0493)، ولا يُستخدم بمفرده. *هذا المُحسِّن ليس محلولًا منظمًا قائمًا بذاته، ولا يُستخدم بمفرده. إضافةً إلى ذلك، لا يُضاف إلى أيٍّ من الخلطات الرئيسية لإنزيم Q5 (M0492، M0494، M0500، E0555). لا يستفيد إنزيم Q5U من مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من الجوانين والسيتوزين، ولا نوصي باستخدامه. قد تُحسِّن إضافة مُضافات تفاعل البوليميراز المتسلسل الشائعة، مثل ما يصل إلى 2% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، من تضخيم بعض الأهداف الصعبة أو الطويلة. غالبًا لا يلزم تغيير درجة حرارة التلدين للتفاعل بعد إضافة مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من الجوانين والسيتوزين. نوصي باستخدام حاسبة درجة حرارة التلدين (Tm) لتحديد درجة حرارة التلدين لتفاعل البوليميراز المتسلسل. تعرّف على المزيد: غالبًا ما يُقلل استخدام مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من GC من نطاق درجات الحرارة الفعّالة التي يُمكن عندها ملاحظة تضخيم مُحدد، وذلك عن طريق تقليل البنى الثانوية المُعقدة للقالب، مما قد يزيد من تضخيم الحمض النووي المستهدف ويُحسّن من إنتاجية المنتجات التي يصعب تضخيمها، مثل القوالب الغنية بـ GC. بشكل عام، تعمل إضافات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عادةً بإحدى طريقتين: الأولى، عن طريق تقليل البنى الثانوية للحمض النووي، وبالتالي زيادة تضخيم الحمض النووي المستهدف. يُمكن زعزعة استقرار البنى الثانوية للحمض النووي بواسطة إضافات ترتبط بالأخاديد الصغرى والكبرى للحمض النووي وتؤثر على الروابط الهيدروجينية للثنائي. تشمل البنى الثانوية الحلزون المزدوج (زيادة الروابط الهيدروجينية بسبب زيادة محتوى GC) وبنى الحلقة الجذعية (دبابيس الشعر أو النيوكليوتيدات المنتفخة التي تُقلل من التهجين). الثانية، عن طريق تقليل التمهيد غير المُحدد، وبالتالي تقليل تضخيم الحمض النووي خارج الهدف.