نيو إنجلاند بيولابس، M0515S، Q5U® بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة بتقنية البدء الساخن

إنزيم Q5U Hot Start عالي الدقة لبوليميراز الحمض النووي هو نسخة معدلة من Q5. التصنيفات ذات الصلة: تحليل مثيلة الحمض النووي عن طريق تحويل البيسلفيت، تحليل مثيلة الحمض النووي، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، تطبيقات تقنيات التضخيم، تطبيقات إنزيمات USER® و USER II الحرارية، تسلسل البيسلفيت، USER®، الاستنساخ. الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكنني منع التلوث المتبقي باستخدام Q5U؟ ج: لمنع التلوث المتبقي، يمكن إضافة dUTP (NEB #N0459) و UDG الحراري غير المستقر في القطب الجنوبي (NEB #M0372) إلى التفاعل. للحصول على أفضل النتائج، نوصي بإضافة dUTP بتركيز نهائي 200 ميكرومولار. يمكن استبدال dTTP بالكامل بـ dUTP، وبالنسبة للعديد من الأهداف، لا يُلاحظ أي انخفاض في الإنتاجية. لتنشيط UDG، يجب إضافة خطوة حضانة لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية قبل خطوة التمسخ الأولية. يمكن استخدام معايير التدوير النموذجية بعد ذلك. س: هل يمكنني استخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U Hot Start لتضخيم الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت؟ ج: نعم. بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U Hot Start هو نسخة معدلة من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5، وهو يُضخّم بكفاءة القوالب المحتوية على اليوراسيل. تختلف ظروف التدوير المثلى للحمض النووي المعالج بالبيسلفيت عن التطبيقات الأخرى. يُرجى مراجعة القسم 2 من البروتوكول لمزيد من التفاصيل. س: ما هي التوصيات العامة لتصميم البادئات للحمض النووي المعالج/المُنزوع الأمين بالبيسلفيت؟ ج: نوصي بتصميم بادئات أوليغونوكليوتيدية طويلة (حوالي 26-35) لتضخيم الحمض النووي المعالج/المُنزوع الأمين بالبيسلفيت. نظرًا لأن الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت غالبًا ما يكون تالفًا، فمن الأفضل تصميم أهداف يتراوح طولها بين 150 و500 زوج قاعدي. لاحظ أنه نظرًا لأن خيوط الحمض النووي لم تعد متكاملة بعد المعالجة بالبيسلفيت/إزالة الأمين، فإن مجموعة البادئات الفردية ستضخم خيطًا واحدًا فقط من التسلسل المستهدف. يجب تصميم البادئ الأول ليرتبط بالتسلسل المستهدف المُحوَّل. أما البادئ الثاني، فيجب تصميمه ليرتبط بناتج استطالة البادئ الأول، وليس بخيط القالب المقابل، كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي. يُوصى باستخدام بادئات ذات درجات حرارة ارتباط أعلى (>60 درجة مئوية كما هو محدد بواسطة حاسبة NEB Tm) للحصول على أفضل أداء. إذا لزم الأمر، أضف أكبر عدد ممكن من قواعد الجوانين في منطقة البادئ أو أضف قواعد إضافية لزيادة درجة حرارة الانصهار (Tm). كما أن البادئات الأطول ستزيد من الخصوصية. من الناحية المثالية، يجب تجنب مواقع CpG؛ وإذا كان ذلك ضروريًا، فأضفها إلى الطرف 5′ من البادئ واجعلها تُصنَّع بقاعدة مختلطة (Y = C/T، R = G/A) في موضع السيتوزين. يمكن استخدام برامج حاسوبية مثل MethPrimer وmethBLAST وBiSearch لتصميم أو تحليل البادئات. عادةً ما تُلاحظ أفضل النتائج عند استخدام كل بادئ بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكرومولار في التفاعل. س: هل يمكنني استخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U Hot Start لطرق استنساخ USER®؟ ج: نعم. بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U Hot Start هو بوليميراز حمض نووي عالي الدقة Q5 مُعدّل، يُضخّم بكفاءة قوالب وبادئات تحتوي على اليوراسيل. في طرق استنساخ USER، تُولّد جزيئات الحمض النووي المستهدفة وناقل الاستنساخ بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع 8-12 قاعدة متماثلة بين قطعتين. تبدأ بادئات PCR بقاعدة أدينين (A) في الطرف 5′ وتحتوي على بقايا ديوكسي يوراسيل (dU) واحدة تُحيط بالطرف 3′ لمنطقة التماثل، ويمكن تصميمها لاستيعاب تجميع قطع متعددة، واستبدال النيوكليوتيدات، والإدخالات، و/أو الحذف. نوصي باستخدام برنامج GeneDesign لتصميم البادئات لوصلات USER. عادةً ما تُلاحظ أفضل النتائج عند استخدام كل بادئ بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكرومولار. بالمقارنة مع الإنزيمات القائمة على Taq، يُقلل إنزيم Q5U Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase الأخطاء بشكل ملحوظ، مما يُبسط أي بروتوكول استنساخ (انظر البيانات أدناه على سبيل المثال). أُجري استنساخ USER لربط جين lacZ بطول 3 كيلوبايت في هيكل ناقل pET21a باستخدام إنزيم Q5U Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase وإنزيم Hot Start Taq DNA polymerase. أدت التفاعلات التي تحتوي على Q5U إلى كفاءة تجميع أعلى ودقة أفضل، كما يتضح من العدد الإجمالي للمستعمرات المُحصل عليها (أ) ونسبة المستعمرات الزرقاء (ب). تم فحص الدقة بشكل إضافي باستخدام تسلسل سانجر، والذي كشف عن عدد من الطفرات النقطية في المستعمرات الزرقاء المُحصل عليها من تجميع Taq، وعدم وجود طفرات في المستنسخات الأربعة التي تم تسلسلها من تجارب Q5U (ج). تشير علامة "X" إلى عدد الطفرات الإضافية الموجودة في المستنسخات المنتجة باستخدام إنزيم Taq، بما يتوافق مع النتائج السابقة التي تُظهر تحمل lacZ العالي للطفرات. (Barnes, WM (1992) Gene, 112, 29-35.) س: هل يُمكنني استخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U Hot Start لتضخيم الحمض النووي المستخلص من أنسجة مثبتة بالفورمالين ومضمنة في البارافين (FFPE)؟ ج: نعم. بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U Hot Start هو بوليميراز حمض نووي Q5 مُعدّل، قادر على تضخيم عدد من القواعد المُعدّلة الموجودة عادةً في القوالب التالفة. يعتمد نجاح تضخيم المواد المُستخلصة من أنسجة FFPE على نوع الركيزة والهدف. س: ما هي نهايات نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، راجع الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq تسلسل 3'A غير مُستنسخ، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. ومع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون لها امتداد 3'A. س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart® ومتى يُمكنني استخدامها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير مُحدد. ماذا يعني Hot Start/Warm Start؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® الخاصة بنا أبتاميرات تُثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يُقلل من تكوين نواتج غير مُحددة. لا يُؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين تقنية البدء الساخن وتقنية البدء الدافئ هو أن إنزيمات البدء الساخن محبة للحرارة، بينما إنزيمات البدء الدافئ محبة للحرارة المعتدلة؛ ويتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات المستخدمة في كلتا التقنيتين إلى حد كبير. الأبتاميرات عبارة عن نيوكليوتيدات قليلة مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد من خلال تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النيوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تتمثل ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا تُسمى هذه التقنية "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. سؤال: كيف يمكنني تحديد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج من البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل المتدرج (PCR). يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المستخدم. على عكس الحاسبات الأخرى، تأخذ حاسبة Tm من NEB في الاعتبار مكونات المحلول التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تُقلل الحاسبات الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. لمزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يُرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البلمرة المتسلسل وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البلمرة المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تُعزز التفاعل المحدد للبادئ مع مُكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المُختارة. بينما تُعدّ درجات حرارة التلدين قيمًا ثابتة يختارها العالم، فإن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ وقالب الحمض النووي قد تختلف من مُضخّم لآخر. ملاحظة: يتناول هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ أوليغونوكليوتيد بقالب الحمض النووي. خلال مرحلة التمسخ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، تفصل درجة الحرارة العالية قالب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، كاشفةً عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتلدين (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيد أحادي السلسلة مُكمّل عند درجة حرارة أقل. درجة حرارة التلدين (TA) هي درجة الحرارة المستخدمة خلال مرحلة تلدين البادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل، وهي تعتمد على درجة حرارة انصهار البادئ. درجة حرارة انصهار البادئ (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئ بمُكمّله المثالي، بينما يكون 50% منه حرًا في المحلول نتيجةً لانفصاله ("انصهاره") عن مُكمّله. لماذا يُعدّ استخدام درجة حرارة التلدين الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التلدين أقل من درجة حرارة الانصهار لضمان تهجين البادئ مع القالب. إذا كانت درجة حرارة التلدين مرتفعة جدًا، فلن يرتبط البادئ بالقالب ولن تتم عملية التضخيم. أما إذا كانت منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي للبادئ (أو البادئات) بالقالب أو ببعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب بسبب ظروف التفاعل غير الفعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على درجة حرارة انصهار البادئ ودرجة حرارة التلدين. لا تُعدّ درجات حرارة الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، بل تتأثر بعدد من العوامل، منها: طول البادئ ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC)، والتي تحدد مقدار الروابط الهيدروجينية بين البادئ ومكمله. كلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة انصهار) البادئ مع قالبه، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئ: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي ينبغي أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يُحدد التركيز الحر لأيونات المغنيسيوم [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة المتفاعلات والنواتج في تفاعل البلمرة المتسلسل. ترتبط الشحنة الموجبة للمغنيسيوم بالفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات والبادئات والحمض النووي أحادي السلسلة. يؤدي تقليل التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئ وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز البادئات. تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+): تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: ما هي خصائص هذا البوليميراز (الدقة، نهايات المنتج، الحد الأقصى للتضخيم، دمج القاعدة المعدلة، إلخ)؟ أ: دقة منتجات البوليميراز* معدل الخطأ نهايات المنتج أقصى طول للمنتج** درجة حرارة التمديد دمج النيوكليوتيدات المعدلة*** دمج اليوراسيل إكسونوكلياز 5´-3´ 3´-5´ (تدقيق لغوي) إكسونوكلياز بوليميراز Q5 280X <0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC، 6mA لا (باستثناء Q5U) - ++++ بوليميراز فيوجن 39-50X 0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC لا - ++++ بوليميراز ون تاك 2X <140 × 10-6 3´A/blunt 6kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + ++ بوليميراز Taq 1X 2.85 x 10^-4 3´A 5kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2kb 68°C نعم لا - بوليميراز LongAmp® 2X 3´A/blunt 30kb 65°C لا نعم ++ *الدقة نسبةً إلى بوليميراز Taq DNA. نواصل البحث في المقايسات لتوصيف معدل الخطأ المنخفض جدًا لـ Q5 لضمان تقديم بيانات الدقة الأكثر دقةً الممكنة (Potapov, V, and Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **تشمل القوالب البسيطة البلازميدات والفيروسات والحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية. وتشمل القوالب المعقدة الحمض النووي الجينومي للنباتات والبشر والثدييات الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي المكمل (cDNA). *** لمزيد من المعلومات، تواصل مع الدعم الفني عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. لمزيد من المعلومات حول الخصائص التي تساعدك في اختيار بوليميراز مناسب لتطبيقك، يُرجى الاطلاع على مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. تعرّف على المزيد حول الدقة ومعدل الخطأ: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة، بينما يُعرَّف معدل الخطأ بأنه معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. تُعد الدقة مهمة للتطبيقات التي يجب أن يكون فيها تسلسل الحمض النووي صحيحًا بعد التضخيم. لمعرفة المزيد حول كيفية قياس الدقة، انقر هنا. نهايات المنتج ونشاط الإكسونوكلياز: اطّلع على قسم "تعرّف على المزيد" في الأسئلة الشائعة حول نهايات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والأسئلة الشائعة حول نشاط الإكسونوكلياز لبوليميرازات الحمض النووي. س: نتائجي ليست كما هو متوقع. أين يمكنني العثور على مساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟ أ: تضخيم غير نوعي، أو عدم حدوث تضخيم، أو حجم ناتج غير صحيح. هل لديك نتيجة غير متوقعة؟ راجع دليل استكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وإصلاحها بعد انتهاء التفاعل لتحديد الأسباب المحتملة للنتائج غير المتوقعة والحلول. يمكنك الاطلاع على المزيد من التفاصيل حول ظروف التفاعل وتحسين الإعداد في إرشاداتنا لتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة، وفي هذه المدونة. يسعد فريق الدعم الفني دائمًا بمساعدتك في استكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل وإصلاحها. إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة، يمكنك: مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على info@neb.com، أو الاتصال بالدعم الفني على الرقم (800)-0632-7799، متاح من الاثنين إلى الجمعة، من الساعة 9:00 صباحًا حتى 6:00 مساءً بتوقيت شرق الولايات المتحدة، أو ملء هذا النموذج الإلكتروني. فشل تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت: إذا كنت تواجه صعوبة في تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت، فجرب بعض هذه النصائح: نوصي باستخدام بوليميراز Q5® أو Phusion® أو LongAmp®. إذا كنت تستخدم Q5، فحاول تقليل تركيز البادئ النهائي إلى 150-300 نانومتر. تتيح تركيبات الإنزيم والمحلول المنظم المستقلة مرونة أكبر في تحسين التفاعل مقارنةً بالخلطات الرئيسية. استخدم المزيد من القالب. تعامل مع القالب المنقى برفق حتى لا يتلف. حسّن تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زد عدد الدورات. أطل وقت التمديد إلى 40 ثانية/كيلوبايت. التلطيخ على هلام الأغاروز: عند عدم توفر ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المثلى، غالبًا ما تُلاحظ لطخة أو مستوى عالٍ من الخلفية. جرّب واحدًا أو أكثر من الاقتراحات التالية: استخدم كمية أقل من الإنزيم، خفّض درجة حرارة التمديد بمقدار 3 درجات مئوية عن درجة حرارة التمديد الموصى بها في بروتوكول المنتج المحدد. على سبيل المثال، يوصي بروتوكول OneTaq® بدرجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؛ جرّب 65 درجة مئوية. ارفع درجة حرارة التلدين. جرّب بروتوكولات دورات ثنائية الخطوات. إذا كانت هناك هالة مضيئة حول البئر بالإضافة إلى اللطخة من البئر، فاستخدم كمية أقل من القالب. س: ما هي الاختلافات بين منتجات بوليميراز Q5® العديدة المتوفرة؟ ج: يُوصى باستخدام تركيبات الإنزيم المستقلة (NEB #M0491، #M0493) لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل المرن وللقوالب ذات المحتوى العالي من GC (عن طريق إضافة مُحسِّن المحتوى العالي من GC إلى التفاعل). توفر تركيبات المزيج الرئيسي (NEB #M0492، #M0494) أقصى درجات الراحة لاحتوائها على الإنزيم، وأيونات المغنيسيوم (Mg2+)، والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، وجميع مكونات المحلول المنظم اللازمة لدعم تضخيم قوي - لا يلزم سوى إضافة القالب والبادئات. تعمل تركيبات البدء الساخن (NEB #M0493، #M0494) على تثبيط نشاط الإنزيم، مما يسمح بإعداد التفاعل بسهولة في درجة حرارة الغرفة، وهي مناسبة لجميع تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي تتطلب دقة أعلى، أو خصوصية عالية، أو تضخيم أهداف صعبة أو طويلة. لمزيد من المعلومات حول تقنية البدء الساخن، انقر هنا. تم تحسين تركيبات NEBNext® Q5 (NEB #M0541، #M0543، #M0544) خصيصًا للحد من تحيز GC أثناء تضخيم مكتبات التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS). يُعد M0544 المزيج الرئيسي المقترح لتطبيقات NGS. تم تصميم مزيج Q5 Blood Direct 2X الرئيسي (NEB #M0500) خصيصًا لعينات الدم دون الحاجة إلى خطوة تنقية. إنه إنزيم بدء ساخن. لا يستطيع بوليميراز Q5 قراءة اليوراسيل أو دمجه، بينما يستطيع بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5U® Hot Start (NEB #M0515) ذلك. استخدمه مع قوالب الحمض النووي التي تحتوي على اليوراسيل، أو المحولة بالبيسلفيت، أو منزوعة الأمين، أو التالفة. يمكن استخدام Q5U وdUTP/dTTP لمنع التلوث العابر. إنه إنزيم بدء ساخن. س: متى وكيف يجب استخدام مُحسِّن Q5® عالي GC؟ ج: مُحسِّن Q5 عالي GC هو مُضاف يُنصح باستخدامه عند التعامل مع قوالب صعبة أو ذات محتوى GC عالٍ، ولكنه قد يكون مُثبِّطًا عند استخدام قوالب ذات محتوى AT عالٍ. يمكن لإنزيم Q5 المُستقل تغطية نطاق أوسع من محتوى GC (يصل إلى 80%) مع إضافة مُحسِّن GC. مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من الجوانين والسيتوزين هو مُكمِّل لتركيبات إنزيم Q5 والمحاليل المنظمة (M0491 وM0493)، ولا يُستخدم بمفرده. *هذا المُحسِّن ليس محلولًا منظمًا قائمًا بذاته، ولا يُستخدم بمفرده. إضافةً إلى ذلك، لا يُضاف إلى أيٍّ من الخلطات الرئيسية لإنزيم Q5 (M0492، M0494، M0500، E0555). لا يستفيد إنزيم Q5U من مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من الجوانين والسيتوزين، ولا نوصي باستخدامه. قد تُحسِّن إضافة مُضافات تفاعل البوليميراز المتسلسل الشائعة، مثل ما يصل إلى 2% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، من تضخيم بعض الأهداف الصعبة أو الطويلة. غالبًا لا يلزم تغيير درجة حرارة التلدين للتفاعل بعد إضافة مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من الجوانين والسيتوزين. نوصي باستخدام حاسبة درجة حرارة التلدين (Tm) لتحديد درجة حرارة التلدين لتفاعل البوليميراز المتسلسل. تعرّف على المزيد: غالبًا ما يُقلل استخدام مُحسِّن Q5 عالي المحتوى من GC من نطاق درجات الحرارة الفعّالة التي يُمكن عندها مُلاحظة تضخيم مُحدد، وذلك عن طريق تقليل البنى الثانوية المُعقدة للقالب، مما قد يزيد من تضخيم الحمض النووي المُستهدف ويُحسّن من إنتاجية المنتجات التي يصعب تضخيمها، مثل القوالب الغنية بـ GC. بشكل عام، تعمل إضافات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عادةً بإحدى طريقتين: الأولى، عن طريق تقليل البنى الثانوية للحمض النووي، وبالتالي زيادة تضخيم الحمض النووي المُستهدف. يُمكن أن تُزعزع الإضافات التي ترتبط بالأخاديد الصغرى والكبرى للحمض النووي، وتؤثر على الروابط الهيدروجينية للثنائي، استقرار البنى الثانوية للحمض النووي. تشمل البنى الثانوية الحلزون المزدوج (زيادة الروابط الهيدروجينية بسبب زيادة محتوى GC) وبنى الحلقة الجذعية (دبابيس الشعر أو النيوكليوتيدات المنتفخة التي تُقلل من التهجين). الثانية، عن طريق تقليل التمهيد غير المُحدد، وبالتالي تقليل تضخيم الحمض النووي خارج الهدف. سؤال: هل يُمكنني استخدام مُحلول تفاعل Q5 مع هذا الإنزيم؟ ج: يُوصى باستخدام محلول التفاعل Q5U 5X المرفق مع الإنزيم كخيار أول لتضخيم قوي وعالي الدقة. يحتوي محلول التفاعل Q5U 5X على 2.0 ملي مولار من أيونات المغنيسيوم (Mg++) بتركيز نهائي (1X). س: كيف يُمكنني تحسين إنتاجية المنتج باستخدام بوليميراز الحمض النووي Q5U Hot Start عالي الدقة؟ ج: يعتمد التحسين على التطبيق والمادة الأولية. يُمكن الاطلاع على التوصيات المُحددة في البروتوكولات. فيما يلي إرشادات عامة: قم بإجراء تدرج حراري لتحسين درجة حرارة الانصهار (Tm). على عكس أنواع البوليميراز الأخرى، مثل Taq، قد يكون التضخيم عالي الدقة حساسًا لدرجات حرارة التلدين، حيث قد تُحدث درجة أو درجتان فرقًا بين عدم حدوث تضخيم ونجاح تضخيم منتج نقي ذي إنتاجية عالية. انظر البيانات أدناه كمثال. استخدم كمية أكبر من القالب. قد يكون تركيز العينة منخفضًا جدًا. يمكن تحسين تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زيادة عدد الدورات. إطالة وقت التمديد إلى دقيقة واحدة لكل كيلو قاعدة. تغيير درجة حرارة التمديد - قد تستفيد بعض التطبيقات (تضخيم الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت، أو منزوع الأمين، أو التالف) من استخدام درجة حرارة تمديد أعلى من الموصى بها (72 درجة مئوية مقابل 68 درجة مئوية). يمكن لتحسين درجة حرارة التلدين تحسين نتائج التضخيم. يكشف التضخيم عالي الدقة لـ PSMB2 كدالة لدرجة الحرارة أن التضخيم القوي يبدأ عند 65.6 درجة، بينما لا يُلاحظ تضخيم يُذكر عند درجتين أقل.