نيو إنجلاند بيولابس، M0523S، RNase H المقاوم للحرارة

يتعرف إنزيم RNase H المقاوم للحرارة على روابط الفوسفودايستر في سلسلة الحمض النووي الريبوزي (RNA) ضمن هجين RNA-DNA ويقطعها، مع الحفاظ على سلامة سلسلة DNA. يتميز هذا الإنزيم النيوكليازي المقاوم للحرارة بنفس الخصائص الإنزيمية للفئات ذات الصلة : إنزيمات RNase، وتخليق cDNA، وإنزيمات النسخ العكسي. تشمل تطبيقاته: التضخيم بوساطة النسخ وتضخيم NASBA، وتخليق cDNA، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإنتاج 1 نانومول من النيوكليوتيدات الريبوزية من 40 بيكومول من هجين RNA:DNA مكون من 25 زوجًا قاعديًا وموسوم بصبغة فلورية، وذلك في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر خلال 20 دقيقة عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل RNase H بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة ≥50 درجة مئوية. محلول تفاعل RNase H بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 75 ملي مولار KCl، 3 ملي مولار MgCl2، 10 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 8.3 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% Triton® X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري : لا. الأسئلة الشائعة : س: عند إذابة محلول تفاعل RNase H بتركيز 10X، ألاحظ وجود راسب أبيض. ما هو وماذا أفعل حياله؟ ج: الراسب الأبيض هو DTT الموجود في المحلول بتركيز 10X، وسيعود للذوبان عند الإذابة والخلط. المحلول المُعلق جاهز للاستخدام المقصود. س: ما الفرق بين إنزيم RNase H من الإشريكية القولونية (NEB #M0297) وإنزيم RNase H المقاوم للحرارة (NEB #M0523)؟ ج: يقوم كل من إنزيم RNase H المقاوم للحرارة وإنزيم RNase H من الإشريكية القولونية بفصل الحمض النووي الريبي (RNA) في جزيء هجين من الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA)، مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA)؛ فهما لا يفصلان الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين أحادي أو مزدوج السلسلة. مع ذلك، يتميز إنزيم RNase H المقاوم للحرارة بنشاطه ضمن نطاق حراري أوسع من إنزيم الإشريكية القولونية، حيث يكون نشاطه الأمثل عند 65 درجة مئوية، ويتراوح نطاق نشاطه بين 37 و95 درجة مئوية. س: من أي جانب من قاعدة الحمض النووي الريبي يفصل إنزيم RNase H المقاوم للحرارة؟ ج: على غرار إنزيم RNase H في بكتيريا الإشريكية القولونية، يعمل إنزيم RNase H المقاوم للحرارة كإنزيم داخلي لقطع الرابطة الفوسفودايسترية في الحمض النووي الريبي، مُنتجًا مجموعات هيدروكسيل 3' ومجموعات فوسفات 5'. س: ما هي درجة حرارة التفاعل المثلى لإنزيم RNase H المقاوم للحرارة؟ ج: يكون إنزيم RNase H المقاوم للحرارة نشطًا ضمن نطاق واسع من درجات الحرارة (37-95 درجة مئوية). يعتمد نشاطه على درجة انصهار الركيزة الهجينة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي منقوص الأكسجين، وقدرة الركيزة على البقاء مزدوجة السلاسل عند درجة حرارة التفاعل المختارة. س: هل يكون إنزيم RNase H المقاوم للحرارة نشطًا في محاليل منظمة أخرى؟ ج: يتطلب إنزيم RNase H المقاوم للحرارة أيونات المغنيسيوم (Mg2+) ليكون نشطًا، لذا قد تكون المحاليل المنظمة التي تحتوي على كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) مناسبة لتفاعلات إنزيم RNase H المقاوم للحرارة. المحلول الأمثل للتفاعل هو محلول تفاعل RNase H بتركيز 1X، ولكننا اختبرنا محاليل NEBuffers من 1 إلى 4، ومحاليل NEBuffers من r1.1 إلى r3.1، ومحلول rCutSmart®: المحلول 37°م 50°م 65°م >65°م محلول RNase H +++ +++ +++ +++ +++ NEBuffer 1 ++ ++ ++ ++ NEBuffer 2; +++ +++ ++ ++ NEBuffer 3 +++ +++ +++ + NEBuffer 4 ++ +++ +++ +++ NEBuffer r1.1 ++ ++ +++ - NEBuffer r2.1 ++ ++ ++ ++ NEBuffer r3.1 +++ +++ +++ - rCutSmart Buffer ++ ++ ++ + س: هل يقوم إنزيم RNase H المقاوم للحرارة بقطع الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة؟ س: هل إنزيم RNase H المقاوم للحرارة يقطع سلسلة الحمض النووي الريبوزي (RNA) فقط في جزيء هجين من الحمض النووي الريبوزي والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (RNA:DNA)؟ ج: لا. س: هل يحتاج إنزيم RNase H المقاوم للحرارة إلى عوامل مساعدة للنشاط؟ ج: نعم. يحتاج إنزيم RNase H المقاوم للحرارة إلى أيونات المغنيسيوم (Mg2+) للنشاط، وهي موجودة في محلول التفاعل 10X RNase H المرفق مع الإنزيم. س: هل يمكن تعطيل إنزيم RNase H المقاوم للحرارة بالحرارة؟ ج: لا. إنزيم RNase H المقاوم للحرارة مستقر عند درجات حرارة عالية (> 95 درجة مئوية) ولا يمكن تعطيله بالحرارة. يمكن تعطيل الإنزيم عن طريق حضنه مع بروتينيز K أو إضافة EDTA. س: ما هي التطبيقات المناسبة لإنزيم RNase H المقاوم للحرارة؟ أ: يمكن استخدام إنزيم RNase H المقاوم للحرارة كبديل لإنزيم RNase H الخاص ببكتيريا الإشريكية القولونية في فحوصات مثل رسم خرائط بنية الحمض النووي الريبوزي، والقطع الموضعي للحمض النووي الريبوزي، وطرق التضخيم متساوي الحرارة، وإزالة الحمض النووي الريبوزي الرسول أثناء تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الثانية، وإزالة ذيول عديد الأدينين من الحمض النووي الريبوزي الرسول عند تهجينه مع قليل النوكليوتيدات dT. ونظرًا لزيادة استقرار إنزيم RNase H المقاوم للحرارة عند درجات حرارة أعلى، فإن الفحوصات التي تتطلب دقة أعلى قد تستفيد من استخدام هذا الإنزيم.