نيو إنجلاند بيولابس، M0525L، نظام التنظيف السريع CIP

يحل هذا المنتج محل الفئات ذات الصلة : الفوسفاتازات، وتطبيقات تعديل الحمض النووي الريبي، وإزالة الفسفرة، والاستنساخ السريع: قم بتسريع عمليات الاستنساخ الخاصة بك باستخدام الكواشف من NEB. مواصفات الوحدة: تعريف الوحدة الواحدة هي كمية الإنزيم التي تحلل 1 ميكرومول من فوسفات بارا-نيتروفينيل، PNPP (NEB #P0757) في حجم تفاعل إجمالي قدره 1 مل في دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار من أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار من أسيتات التريس، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 25 ملي مولار من Tris-HCl، 1 ملي مولار من MgCl2، 0.1 ملي مولار من ZnCl2، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين. شروط قياس الوحدة: 1 مولار من ثنائي إيثانول أمين-HCl (الأس الهيدروجيني 9.8)، 0.5 ملي مولار من MgCl2، 50 ملي مولار من فوسفات بارا-نيتروفينيل. تُستخدم هذه الشروط فقط لتحديد كمية نشاط الإنزيم. الأسئلة الشائعة : س: أي من الفوسفاتاز القلوي، Quick CIP أو rSAP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي، هو الأفضل؟ ج: يُعد Quick CIP (NEB #M0525) الخيار الأمثل لأنه يوفر بروتوكولًا سريعًا، ولا يتطلب أي إضافات، ويتميز بنشاط نوعي عالٍ. يُفضل Quick CIP على فوسفاتاز القطب الجنوبي لأنه لا يتطلب إضافة الزنك أو أي عوامل مساعدة أخرى في محلول التفاعل. ونتيجة لذلك، يمكن إضافة Quick CIP مباشرةً إلى نواتج هضم إنزيمات التقييد. بالإضافة إلى ذلك، بعد تعطيل هذا الإنزيم بالحرارة، لا داعي لتنقية الحمض النووي الناقل قبل تفاعل الربط. س: يبدو عدد المستعمرات التي لا تحتوي على قطعة مُدرجة مرتفعًا. كيف يمكنني التأكد من نجاح Quick CIP؟ ج: Quick CIP إنزيم قوي جدًا، ومن النادر ألا تكتمل عملية إزالة الفسفرة. يمكن استخدام عنصر التحكم في التحويل التالي لتشخيص هذه المشكلة: 1. ناقل غير مقطوع: للتحقق من كفاءة الخلية ومقاومتها للمضادات الحيوية. ٢. قطع الناقل دون ربطه: للتحقق من وجود ناقل غير مقطوع. قد يلزم تنقية الناقل باستخدام الجل (نوصي باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي من جل مونارك، NEB #T1020) لإزالة آخر ٠.١٪ من الناقل غير المقطوع. ٣. قطع الناقل وربطه: للتحقق من سلامة النهايات وظروف الربط. ٤. قطع الناقل وإزالة الفوسفات منه وربطه: للتحقق من إزالة الفوسفات. يجب أن يكون إجمالي عدد المستعمرات أقل من ٥٪ من الناقل المقطوع والمربوط. س: ما هي مجموعات الفوسفات التي تتم إزالتها بواسطة rSAP أو Quick CIP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (AnP)؟ ج: تقوم إنزيمات rSAP وQuick CIP وAnP، كما هو الحال مع أي فوسفاتاز قلوي، بإزالة الفوسفات من نهايتي ٥' و٣' للحمض النووي DNA وRNA أحادي السلسلة وثنائي السلسلة، كما تقوم بإزالة الفوسفات من dNTPs. لا تُؤثر الفوسفاتازات القلوية (بما في ذلك rSAP وQuick CIP وAnP) على بنية غطاء 5' للحمض النووي الريبي. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد المعالجة بـ Quick CIP؟ ج: لا، طالما تم تعطيل Quick CIP حراريًا عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين قبل الربط. مع ذلك، إذا تم إجراء تفاعل إزالة الفسفرة مباشرةً بعد هضم الحمض النووي للناقل، فيجب تعطيل كل من إنزيم التقييد وQuick CIP حراريًا. في هذه الحالة، يُرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة لتعطيل إنزيم التقييد. س: ما تأثير عوامل استخلاب المعادن والفوسفات غير العضوي ونظائر الفوسفات على نشاط Quick CIP؟ ج: عوامل استخلاب المعادن والفوسفات غير العضوي ونظائر الفوسفات مثبطة. س: ما تأثير الأملاح أحادية التكافؤ على نشاط Quick CIP؟ ج: وجود الأملاح أحادية التكافؤ يُعزز نشاط Quick CIP. س: ما تأثير عوامل الاختزال على نشاط Quick CIP؟ ج: وجود عوامل الاختزال يقلل من فعالية إنزيم Quick CIP. س: هل يقوم إنزيم Quick CIP أو rSAP أو فوسفاتاز القطب الجنوبي (AnP) بإزالة الفوسفات من البروتينات؟ ج: يمكن استخدام إنزيم Quick CIP أو rSAP أو AnP لإزالة الفوسفات من البروتينات، ومع ذلك، توصي شركة NEB باستخدام فوسفاتاز بروتين لامدا (Lambda PP، رقم المنتج في كتالوج NEB: P0753)، وهو فوسفاتاز بروتين مزدوج ذو نطاق واسع جدًا من التخصص. س: هل يمكن تعطيل إنزيم Quick CIP بالحرارة؟ ج: نعم. قم بتعطيل إنزيم Quick CIP بالحرارة لمدة دقيقتين عند 80 درجة مئوية. س: هل يلزم تنقية الحمض النووي بعد عملية الهضم الإنزيمي وقبل خطوة إزالة الفوسفات؟ ج: إذا كان من الممكن تعطيل الإنزيمات المستخدمة في عملية الهضم الإنزيمي بالحرارة، فلا حاجة لخطوة تنقية. أما إذا كان من غير الممكن تعطيل الإنزيمات المستخدمة بالحرارة، فيُنصح بإجراء خطوة تنظيف بين عملية الهضم الإنزيمي وخطوة إزالة الفوسفات. س: هل الفوسفاتازات القلوية نشطة في محاليل NEBuffers؟ ج: إنزيم Quick CIP (NEB #M0525) وإنزيم rSAP (NEB #M0371) نشطان في جميع محاليل NEBuffers الخاصة بإنزيمات التقييد r1.1 وr2.1 وr3.1 ومحلول rCutSmart™ Buffer (NEB #B6004)، ويمكن إضافتهما مباشرةً إلى الحمض النووي المهضوم. يتطلب إنزيم Antarctic Phosphatase (NEB #M0289) وجود الزنك، ويبلغ نشاطه الأمثل عند درجة حموضة 6.0. يمكن استخدام إنزيم Antarctic Phosphatase في محاليل NEBuffers 1 و2 و3 و4، بالإضافة إلى محاليل NEBuffers الخاصة بإنزيمي EcoRI وBamHI، فقط عند إضافة محلول Antarctic Phosphatase Reaction Buffer بتركيز 10X ليصل التركيز النهائي إلى 1X. س: مشكلة في الاستنساخ: وجود تشويش كبير في خطوة التحويل. ج: في حال وجود تشويش زائد في خطوة التحويل، من المهم تحديد ما إذا كان ذلك ناتجًا عن عدم كفاءة إزالة الفوسفات أو عن وجود بلازميد غير مهضوم متبقٍ من عملية الهضم الإنزيمي. لتحديد مصدر التشويش، يجب إضافة عينتين ضابطتين في خطوة التحويل: ناقل بدون ليغاز، وناقل منزوع الفوسفات مع ليغاز. إذا كان عدد المتحولات في العينة الأولى كبيرًا، فهذا يدل على وجود بلازميد غير مقطوع في الحمض النووي للناقل. أما إذا كان عدد المتحولات في العينة الأولى منخفضًا جدًا، بينما كان عددها في العينة الثانية مرتفعًا، فهذا يدل على عدم كفاءة إزالة الفوسفات. إذا تبين أن خطوة إزالة الفوسفات هي المشكلة، فتأكد من إضافة الكمية الموصى بها من الفوسفاتاز لكل كمية موصى بها من الركيزة. كذلك، تأكد من حضانة العينة للمدة ودرجة الحرارة الموصى بهما. نوصي بتعطيل إنزيمات القطع بالحرارة قبل خطوة إزالة الفوسفات، إذا كان من الممكن تعطيلها بالحرارة. كما نوصي بتعطيل الفوسفاتاز بالحرارة قبل خطوة الربط. إذا تعذر تعطيل الفوسفاتاز بالحرارة، فنوصي بتنظيف الحمض النووي باستخدام عمود الفصل قبل خطوة الربط. يمكن تحقيق ذلك باستخدام مجموعة Monarch PCR & DNA Cleanup (5 ميكروغرام) (NEB #T1030). س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.