نيو إنجلاند بيولابس، M0531S، مزيج فيوجن™ عالي الدقة لتفاعل البوليميراز المتسلسل مع محلول منظم عالي الدقة

لتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي السرعة والأداء. مُصنّع ومُراقب الجودة في مختبرات نيو إنجلاند بيولابس، ثيرمو ساينتيفيك. الفئات ذات الصلة: بوليميرازات الحمض النووي عالية الدقة Phusion™، الخلطات الرئيسية. التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى، تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع، تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة. المواصفات : المواد المطلوبة (غير مُرفقة ): مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB #N0447)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). التعطيل الحراري: لا. شروط فحص الوحدة : 25 ملي مولار TAPS-HCl (الأس الهيدروجيني 9.3 عند 25 درجة مئوية)، 50 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار β-ميركابتوإيثانول، 200 ميكرومولار dNTPs بما في ذلك [3H]-dTTP و15 نانومولار من الحمض النووي M13 المُهيأ. الأسئلة الشائعة : س: ما هي الاختلافات بين منتجات Phusion™ المختلفة المتوفرة؟ أ: توفر صيغ الإنزيم المستقلة (NEB #M0530، #M0535، و#E0553) من بوليميراز Phusion أقصى قدر من المرونة لتحسين التفاعل، وهي مزودة بمحلولين منظمين: HF وGC. محلول HF هو المحلول المنظم الافتراضي. يُنصح باستخدام محلول GC في حال فشل محلول HF أو عند احتواء القوالب على نسبة عالية من GC أو هياكل ثانوية. تتوفر كل من عبوة محلول HF (NEB #B0518) وعبوة محلول GC (NEB #B0519) للشراء بشكل منفصل. كما نوفر تركيبات Phusion الرئيسية الممزوجة مسبقًا بمحلول HF (NEB #M0531) أو محلول GC (NEB #M0532) وdNTPs - ما عليك سوى إضافة القالب والبادئات. تتيح إصدارات Hot Start من بوليميراز Phusion المستقل (NEB #M0535) والمزيج الرئيسي (NEB #M0536) إمكانية التحضير في درجة حرارة الغرفة، وقد تقلل من التضخيم غير النوعي خلال المراحل الأولى من التسخين. لمعرفة المزيد حول التحكم في نشاط إنزيم Hot Start، انقر هنا. تحتوي مجموعة Phusion High-Fidelity PCR Kit (NEB #E0553) على جميع الكواشف اللازمة لتفاعل PCR، بما في ذلك dNTPs وDMSO وعينة تحكم موجبة وسلّم DNA للرحلان الكهربائي الهلامي اللاحق. س: نتائجي ليست كما هو متوقع. أين يمكنني العثور على مساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟ ج: تضخيم غير نوعي، أو عدم وجود تضخيم، أو حجم منتج خاطئ. هل لديك نتيجة غريبة؟ راجع دليل استكشاف أخطاء PCR وإصلاحها بعد تفاعلك لتحديد الأسباب المحتملة للنتائج غير المتوقعة والحلول. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول ظروف التفاعل وتحسين الإعداد في إرشاداتنا لتحسين تفاعل PCR باستخدام بوليميرازات DNA المحبة للحرارة وفي هذه المدونة. يسعد فريق الدعم الفني دائمًا بالعمل معك لاستكشاف أخطاء PCR وإصلاحها. إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة، يمكنك: مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على info@neb.com، أو الاتصال بالدعم الفني على الرقم (800)-0632-7799، متاح من الاثنين إلى الجمعة، من الساعة 9:00 صباحًا حتى 6:00 مساءً بتوقيت شرق الولايات المتحدة، أو ملء هذا النموذج الإلكتروني. فشل تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت: إذا كنت تواجه صعوبة في تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت، فجرب بعض هذه النصائح: نوصي باستخدام بوليميراز Q5® أو Phusion® أو LongAmp®. إذا كنت تستخدم Q5، فحاول تقليل تركيز البادئ النهائي إلى 150-300 نانومتر. تتيح تركيبات الإنزيم والمحلول المنظم المستقلة مرونة أكبر في تحسين التفاعل مقارنةً بالخلطات الرئيسية. استخدم المزيد من القالب. تعامل مع القالب المنقى برفق حتى لا يتلف. حسّن تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زد عدد الدورات. أطل وقت التمديد إلى 40 ثانية/كيلوبايت. التلطيخ على هلام الأغاروز: عند عدم توفر الظروف المثلى لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، غالبًا ما يُلاحظ وجود لطخة أو مستوى عالٍ من الخلفية. جرّب واحدًا أو أكثر من الاقتراحات التالية: استخدم كمية أقل من الإنزيم. خفّض درجة حرارة التمديد بمقدار 3 درجات مئوية عن درجة حرارة التمديد الموصى بها في بروتوكول المنتج المحدد. على سبيل المثال، يوصي بروتوكول OneTaq® بدرجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؛ جرّب 65 درجة مئوية. ارفع درجة حرارة التلدين. جرّب بروتوكولات دورات ثنائية الخطوات. إذا ظهرت هالة مضيئة حول البئر بالإضافة إلى اللطخة من البئر، فاستخدم كمية أقل من القالب. س: ما هي نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq قاعدة 3'A غير مُرتبطة بالقالب، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. ومع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون لها قاعدة 3'A بارزة. س: ما معنى نشاط الإكسونوكلياز بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي؟ ج: يمكن أن تمتلك البوليميرازات نوعين من نشاط الإكسونوكلياز: نشاط الإكسونوكلياز 5'–3' الذي يهضم النيوكليوتيدات في الاتجاه من 5' إلى 3' على القالب قبل نشاط البوليميراز. يمتلك إنزيم بوليميراز Taq نوعًا محددًا من نشاط الإكسونوكلياز 5'-3' يُسمى نشاط إندونوكلياز الطرف 5'، والذي يحفز قطع أطراف الحمض النووي 5' من جزيء DNA مزدوج يحتوي على طرف 5' متدلٍّ أحادي السلسلة على أحد خيوطه. أما نشاط الإكسونوكلياز 3'-5'، المعروف أيضًا بنشاط التدقيق، فيقوم بهضم النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعات هيدروكسيل 3' من الاتجاه 3' إلى 5'. ويشمل ذلك تصحيح أزواج القواعد غير المتطابقة والهضم الطرفي 3'. تمتلك بعض إنزيمات البوليميراز أحد هذين النوعين من نشاط الإكسونوكلياز أو كليهما. في وجود dNTPs، يكون نشاط البلمرة أعلى من نشاط الإكسونوكلياز. بينما لا تمتلك بعض إنزيمات البوليميراز أيًا من هذين النشاطين. للمزيد من المعلومات، ما معنى امتلاك إنزيم بوليميراز لنشاط الإكسونوكلياز 5'-3'؟ عندما تصادف بوليميرازات ذات نشاط إكسونوكلياز 5´-3´ نيوكليوتيدًا في اتجاه 3' على نفس السلسلة، تتحلل روابط الفوسفودايستر في السلسلة المصادفة (تُهضم) قبل بدء عملية البلمرة. يمتلك بوليميراز Taq نوعًا محددًا من نشاط الإكسونوكلياز 5´-3´ يُسمى نشاط إندونوكلياز 5´ flap، والذي يحفز انقسام زوائد الحمض النووي 5´ من جزيء DNA مزدوج يحتوي على نتوء أحادي السلسلة 5' على إحدى السلسلتين. عندما يصادف بوليميراز Taq بنية زوائد كهذه، مثل الفلوروفور الموجود على مسبار التحلل المائي في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR)، فإنه يهضم روابط الفوسفودايستر بين النيوكليوتيدات في اتجاه 5´-3´ بشكل متسلسل قبل بدء عملية البلمرة. يوضح الشكل العلاقة بين نشاط الإكسونوكلياز 3´-5´ (التدقيق) وطول ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تضمن بوليميرازات الحمض النووي دقة التضاعف باستخدام سلسلة من نقاط التفتيش الجزيئية في موقع إدخال النيوكليوتيدات وما بعده. أثناء إضافة النيوكليوتيدات، يتم وضع النيوكليوتيد الصحيح الداخل في موضع مناسب لمحاذاة فعالة للمجموعات التحفيزية، مما يضمن إدخاله بكفاءة. هذه المحاذاة التحفيزية حساسة للتشوهات في الموضع الناتجة عن اقتران قواعد واتسون-كريك غير الصحيح، مما يسمح بتوقف حركي عند أزواج القواعد غير الصحيحة أو غير المتوافقة. تتحقق البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق من إدخال النيوكليوتيد الصحيح في القالب. في حالة اكتشاف عدم تطابق، يُنقل الحمض النووي من نطاق البلمرة إلى نطاق الإكسونوكلياز الطرفي 3' - 5' للبوليميراز. يُستأصل النيوكليوتيد المُدخل بشكل غير صحيح، ويعود الحمض النووي إلى نطاق البلمرة، ويمكن استئناف النسخ. قد يكون لغياب نشاط الإكسونوكلياز 3' - 5' (التدقيق) تداعيات أخرى غير دقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يُعتقد أن افتقار إنزيم Taq DNA بوليميراز لخاصية التدقيق اللغوي يحد من أقصى حجم ممكن للمنتج المُضخّم. عمومًا، يُظهر إنزيم Taq أفضل أداء له عند تضخيم قطع الحمض النووي التي يقل طولها عن 2 كيلوبايت، ولكنه قادر على العمل مع قطع يصل طولها إلى 3-4 كيلوبايت. عند الالتزام بهذا الحجم للمنتج المُضخّم، يُعدّ Taq إنزيمًا قويًا وسهل التحسين. مع ذلك، تنخفض فعاليته بسرعة مع المنتجات التي يزيد طولها عن 3 كيلوبايت تقريبًا. أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، يُدخل إنزيم Taq نيوكليوتيدات خاطئة ويُنتج عدم تطابق، مما يجعله عرضةً للتوقف، ويزيد من احتمالية انفصاله قبل استكمال المنتج كامل الطول. قد يؤدي اجتماع حجم مُضخّم مُعين ومعدل خطأ البوليميراز إلى تراكم عدد كافٍ من النهايات غير المتطابقة في الطرف 3'، مما يُعيق عملية تفاعل البلمرة المتسلسل بشكل فعال. تُشكّل هذه النهايات غير المتطابقة في الطرف 3' مشكلةً خاصةً لإنزيم Taq لأنه يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'→ 5' لإزالتها. بإضافة كمية صغيرة من بوليميراز ذي نشاط إكسونوكلياز مصحح، مثل بوليميراز الحمض النووي Deep Vent®، يمكن تضخيم قطع الحمض النووي التي يبلغ طولها 20 كيلوبايت أو أكثر (انظر بوليميراز الحمض النووي LongAmp®). وبما أن الغالبية العظمى من الإنزيم في المزيج هي بوليميراز الحمض النووي Taq، فمن المرجح أنه يقوم بمعظم عملية إطالة البادئ، بينما يقوم بوليميراز الحمض النووي Deep Vent المصحح بإزالة عدم التطابق 3' المثبط الناتج عن Taq. لمعرفة المزيد عن بنية البوليميراز وكيفية ارتباط البنية بالوظيفة، راجع هذه المقالة. كيف يمكن تثبيط نشاط الإكسونوكلياز أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ أضف روابط فوسفوروثيوات إلى البادئات. رابطة الفوسفوروثيوات (pt) هي رابطة فوسفودايستر حيث تم استبدال إحدى ذرتي الأكسجين غير الجسريتين بذرة كبريت، مما يثبط نشاط الفوسفودايستراز. كيميائيًا، لا يُغير استبدال الأكسجين بالكبريت بشكلٍ كبير من تفاعلية الرابطة، وتظل عديدات النوكليوتيدات المحتوية على pt قادرة على العمل في العديد من التفاعلات الإنزيمية. في معظم الحالات، تكفي 2-3 روابط pt عند الطرف 3' لمنع نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' لبوليميراز الحمض النووي. س: هل يُظهر بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Phusion™ نشاط إزاحة السلسلة؟ ج: لا. يتميز بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Phusion بميل ضعيف للغاية لإزاحة التسلسل غير المُستنسخ في اتجاه المصب، لذا لا يُعتبر ذلك من خصائص الإنزيم. س: ما هي خصائص هذا البوليميراز (الدقة، نهايات المنتج، أقصى حجم مُضخّم، دمج القواعد المُعدّلة، إلخ)؟ أ: دقة منتجات البوليميراز* معدل الخطأ نهايات المنتج أقصى طول للمنتج** درجة حرارة التمديد دمج النيوكليوتيدات المعدلة*** دمج اليوراسيل إكسونوكلياز 5´-3´ 3´-5´ (تدقيق لغوي) إكسونوكلياز بوليميراز Q5 280X <0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC، 6mA لا (باستثناء Q5U) - ++++ بوليميراز فيوجن 39-50X 0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC لا - ++++ بوليميراز ون تاك 2X <140 × 10-6 3´A/blunt 6kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + ++ بوليميراز Taq 1X 2.85 x 10^-4 3´A 5kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2kb 68°C نعم لا - بوليميراز LongAmp® 2X 3´A/blunt 30kb 65°C لا نعم ++ *الدقة نسبةً إلى بوليميراز Taq DNA. نواصل البحث في المقايسات لتوصيف معدل الخطأ المنخفض جدًا لـ Q5 لضمان تقديم بيانات الدقة الأكثر دقةً الممكنة (Potapov, V, and Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **تشمل القوالب البسيطة البلازميدات والفيروسات والحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية. وتشمل القوالب المعقدة الحمض النووي الجينومي للنباتات والبشر والثدييات الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي المكمل (cDNA). *** لمزيد من المعلومات، تواصل مع الدعم الفني عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. لمزيد من المعلومات حول الخصائص التي تساعدك في اختيار بوليميراز مناسب لتطبيقك، يُرجى الاطلاع على مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. تعرّف على المزيد حول الدقة ومعدل الخطأ: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة، بينما يُعرَّف معدل الخطأ بأنه معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. تُعد الدقة مهمة للتطبيقات التي يجب أن يكون فيها تسلسل الحمض النووي صحيحًا بعد التضخيم. لمعرفة المزيد حول كيفية قياس الدقة، انقر هنا. نهايات المنتج ونشاط الإكسونوكلياز: اطّلع على قسم "تعرّف على المزيد" في الأسئلة الشائعة حول نهايات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والأسئلة الشائعة حول نشاط الإكسونوكلياز لبوليميرازات الحمض النووي. س: كيف أحدد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج من البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل المتدرج (PCR). يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المستخدم. على عكس الحاسبات الأخرى، تأخذ حاسبة Tm من NEB في الاعتبار مكونات المحلول التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تُقلل الحاسبات الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. لمزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يُرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البلمرة المتسلسل وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البلمرة المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تُعزز التفاعل المحدد للبادئ مع مُكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المُختارة. بينما تُعدّ درجات حرارة التلدين قيمًا ثابتة يختارها العالم، فإن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ وقالب الحمض النووي قد تختلف من مُضخّم لآخر. ملاحظة: يتناول هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ أوليغونوكليوتيد بقالب الحمض النووي. خلال مرحلة التمسخ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، تفصل درجة الحرارة العالية قالب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، كاشفةً عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتلدين (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيد أحادي السلسلة مُكمّل عند درجة حرارة أقل. درجة حرارة التلدين (TA) هي درجة الحرارة المستخدمة خلال مرحلة تلدين البادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل، وهي تعتمد على درجة حرارة انصهار البادئ. درجة حرارة انصهار البادئ (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئ بمُكمّله المثالي، بينما يكون 50% منه حرًا في المحلول نتيجةً لانفصاله ("انصهاره") عن مُكمّله. لماذا يُعدّ استخدام درجة حرارة التلدين الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التلدين أقل من درجة حرارة الانصهار لضمان تهجين البادئ مع القالب. إذا كانت درجة حرارة التلدين مرتفعة جدًا، فلن يرتبط البادئ بالقالب ولن تتم عملية التضخيم. أما إذا كانت منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي للبادئ (أو البادئات) بالقالب أو ببعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب بسبب ظروف التفاعل غير الفعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على درجة حرارة انصهار البادئ ودرجة حرارة التلدين. لا تُعدّ درجات حرارة الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، بل تتأثر بعدد من العوامل، منها: طول البادئ ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC)، والتي تحدد مقدار الروابط الهيدروجينية بين البادئ ومكمله. كلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة انصهار) البادئ مع قالبه، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئ: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي ينبغي أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يُحدد التركيز الحر لأيونات المغنيسيوم [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة المتفاعلات والنواتج في تفاعل البلمرة المتسلسل. ترتبط الشحنة الموجبة للمغنيسيوم بالفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات والبادئات والحمض النووي أحادي السلسلة. يؤدي تقليل التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئ وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز البادئات. تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+): تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: ما هو تركيز البادئ النهائي الأمثل في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ ج: منتجات البوليميراز، تركيز البادئ النهائي الموصى به (لكل منها)، نطاق تركيز البادئ النهائي (لكل منها): بوليميراز Q5®: 500 نانومتر، 200-1000 نانومتر؛ بوليميراز Phusion®: 500 نانومتر، 200-1000 نانومتر؛ بوليميراز OneTaq®: 200 نانومتر، 50-1000 نانومتر؛ بوليميراز Taq: 200 نانومتر، 50-1000 نانومتر؛ Hemo KlenTaq: 300 نانومتر، 50-1000 نانومتر؛ بوليميراز LongAmp®: 400 نانومتر، 50-1000 نانومتر. نوصي بتركيز نهائي للبادئ يبلغ 500 نانومتر عند استخدام بوليميراز Q5 وPhusion نظرًا لنشاطهما العالي في منطقة 3´-5´ من الإكسونوكلياز. نوصي بتركيز نهائي للبادئات يبلغ 200 نانومتر عند استخدام بوليميرازات Taq، بما في ذلك OneTaq و EpiMark®. يُرجى الرجوع إلى البروتوكولات المحددة في صفحات المنتج للاطلاع على تفاصيل توصيات النطاق. تتميز بوليميرازات عائلة B الأثرية، مثل Q5 و Phusion، بنشاط إكسونوكلياز قوي من 3' إلى 5'، مما قد يؤدي إلى هضم النيوكليوتيدات على الطرف 3' للبادئات وزيادة احتمالية التضخيم غير النوعي. بالمقارنة مع بوليميرازات عائلة A مثل Taq و OneTaq، فإن التركيز النهائي الأعلى للبادئات يتغلب على هذه التأثيرات ويعزز تكوين المنتج النوعي. بشكل عام، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفعال نسبًا مثالية من المغنيسيوم والأيونات الأخرى والبادئات لتعزيز النوعية عن طريق تثبيت الشحنات السالبة على العمود الفقري للفوسفات. على الرغم من أن تركيبة بوليميرازات الحمض النووي Q5 و Phusion هي ملكية خاصة، إلا أن محاليلها المنظمة مُحسَّنة لاستخدام تركيز نهائي للبادئات يبلغ 500 نانومتر.