نيو إنجلاند بيولابس، M0534L، بوليميراز الحمض النووي Taq ذو التشغيل الساخن LongAmp®

الفئات ذات الصلة بـ LongAmp تطبيقات بوليميراز الحمض النووي LongAmp® PCR Hot Start، و PCR Long Range، و PCR Specialty، تعريف وحدة المواصفات : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية. شروط التفاعل : عبوة واحدة من محلول التفاعل LongAmp® Taq Reaction Buffer Pack، 60 مليمولار Tris-SO4، 20 مليمولار (NH4)2SO4، 2 مليمولار MgSO4، 3% جلسرين، 0.06% IGEPAL® CA-630، 0.05% Tween® 20 (الأس الهيدروجيني 9.1 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 مليمولار Tris-HCl، 100 مليمولار KCl، 1 مليمولار DTT، 0.1 مليمولار EDTA، 0.5% Tween® 20، 0.5% IGEPAL® CA-630، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التثبيط الحراري: لا. إكسونوكلياز 5' - 3': نعم. إكسونوكلياز 3' - 5': نعم. إزاحة السلسلة + شروط فحص الوحدة: عبوة واحدة من محلول التفاعل ThermoPol® Reaction Pack محلول منظم، 200 ميكرومول من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) بما في ذلك [3H]-dTTP و15 نانومول من الحمض النووي M13 المُحفَّز. الأسئلة الشائعة : س: هل الحمض النووي الجينومي المُنقَّى بتقنية Monarch مناسب لتفاعل البلمرة المتسلسل طويل المدى (PCR)؟ ج: نعم. حجم القطع الكبير للحمض النووي الجينومي المُنقَّى بتقنية Monarch يجعله مادة أولية ممتازة لتقنيات تفاعل البلمرة المتسلسل طويل المدى. لتفاعل البلمرة المتسلسل طويل المدى، نوصي باستخدام بوليميراز LongAmp TaqDNA (NEB #M0323)، أو مزيج LongAmp Taq 2x Master Mix (NEB #M0287)، أو بوليميراز LongAmp Hot Start Taq (NEB #M0534). يتميز الحمض النووي الجينومي المُنقَّى باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch Spin بجودة عالية ومناسب للتطبيقات الحساسة مثل تفاعل البلمرة المتسلسل طويل المدى وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR). أ. تم إعداد تفاعلات التضخيم باستخدام أزواج من البادئات المُخصصة لتضخيم قطع الحمض النووي البشري بأحجام 6، 8، 10، 12، 16، و20 كيلوبايت. استُخدم مزيج LongAmp® Hot Start Taq 2x Master Mix (NEB #M0533)، وأُضيف 25 نانوغرام من الحمض النووي القالب إلى كل عينة. أُجريت تفاعلات البلمرة المتسلسلة (PCR) على جهاز Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler. قُورن الحمض النووي الجينومي المُنقّى بتقنية Monarch، والمُستخلص من خلايا HeLa ودم الإنسان، بالحمض النووي المرجعي المُتاح تجاريًا من سلالة الخلايا البشرية NA19240 F11. حُمِّل 10 ميكرولتر من أصل 20 ميكرولتر على هلام أجاروز بنسبة 1.5%، باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت (NEB #N3232) كعلامة مرجعية. أشارت النتائج إلى أن الحمض النووي كان عالي النقاء ومناسبًا لتفاعل البلمرة المتسلسلة طويل المدى. ب. خُفِّف الحمض النووي الجينومي المُنقّى بتقنية Monarch، والمُستخلص من دم الإنسان الكامل وخلايا HeLa وذيل الفأر، لإنتاج نطاق لوغاريتمي من خمسة تراكيز قالب مُدخلة. تم الحصول على النتائج باستخدام بادئات تستهدف جين gHEME (من دم بشري كامل) وجين gREL (من خلايا هيلا، ذيل فأر) في فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) وتمت دوراتها على جهاز Bio-Rad® CFX Touch qPCR الحراري. أشارت النتائج إلى أن الحمض النووي عالي النقاء وخالٍ من المثبطات، وهو مثالي لتفاعل qPCR. س: ما هي نهايات نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ أ: منتجات البوليميراز التطبيقية، نهايات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بوليميرازات Q5® عالية الدقة، بوليميرازات Phusion® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات OneTaq® ذات نهايات غير حادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني والمتخصص، بوليميرازات Taq® ذات نهايات غير حادة، بوليميرازات LongAmp® ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Hemo KlenTaq ذو نهايات غير حادة، بوليميرازات Bst ذات نهايات غير حادة، بوليميراز Bsu ذو نهايات غير حادة، بوليميراز phi29 ذو نهايات غير حادة، معالجة الحمض النووي، بوليميراز T7 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز E. coli DNA I ذو نهايات غير حادة، بوليميراز DNA I، جزء كبير (Klenow) ذو نهايات غير حادة، جزء Klenow ذو نهايات غير حادة (3′-5′ خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز T4 DNA ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® ذو نهايات غير حادة، بوليميراز Deep Vent® (خارجي-) ذو نهايات غير حادة للحصول على مزيد من التفاصيل حول بوليميرازاتنا، بما في ذلك أنشطة الإكسونوكلياز وتطبيقاتها، يُرجى زيارة مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. للمزيد من المعلومات حول نشاط الإكسونوكلياز، يُرجى الاطلاع على الأسئلة الشائعة. لماذا تُزيل بعض البوليميرازات النهايات غير المتداخلة بينما تُضيف أخرى نيوكليوتيدًا؟ تُضيف البوليميرازات التي تمتلك نشاط التدقيق (إكسونوكلياز 3'-5')، مثل Q5 وPhusion وDeep Vent، نيوكليوتيدًا غير مُنسوخ إلى نهايات 3' لقطع الحمض النووي الممتدة، ولكن نشاط الإكسونوكلياز يُزيله لاحقًا. أما البوليميرازات الأخرى التي تفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز 3'-5' (مثل Taq والبوليميرازات القائمة على Taq) فتُضيف نيوكليوتيدًا إضافيًا إلى نهايات 3' (غالبًا، ولكن ليس حصريًا، dA) وتترك الجزء غير المُنسوخ سليمًا. لهذا السبب، من المهم معرفة البوليميراز المناسب عند إجراء استنساخ النهايات غير المتداخلة أو استنساخ T/A. إن بوليميرازات الحمض النووي OneTaq وLongAmp Taq عبارة عن مزيج مُحسَّن من بوليميرازات الحمض النووي Taq (بوليميراز من العائلة A) وDeep Vent (بوليميراز من العائلة B). يُضيف نشاط البوليميراز الذاتي لـ Taq تسلسل 3'A غير مُستنسخ، بينما يزيد نشاط الإكسونوكلياز 3'–5' لـ Deep Vent من دقة وقوة Taq، ولكنه يُقلل أيضًا من وضوح نهايات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لهذا السبب، تُنتج هذه النهايات خليطًا من نهايات الحمض النووي. ومع ذلك، فإن غالبية النهايات ستكون لها نهاية 3'A بارزة. س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart® ومتى يُمكنني استخدامها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير مُحدد. ماذا يعني Hot Start/Warm Start؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® الخاصة بنا أبتاميرات تُثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يُقلل من تكوين نواتج غير مُحددة. لا يُؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين تقنية البدء الساخن وتقنية البدء الدافئ هو أن إنزيمات البدء الساخن محبة للحرارة، بينما إنزيمات البدء الدافئ محبة للحرارة المعتدلة؛ ويتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات المستخدمة في كلتا التقنيتين إلى حد كبير. الأبتاميرات عبارة عن نيوكليوتيدات قليلة مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد من خلال تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النيوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تتمثل ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا تُسمى هذه التقنية "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. سؤال: كيف يمكنني تحديد درجة حرارة التلدين المناسبة لتفاعلي؟ ج: يمكن تحديد درجة حرارة التلدين المثلى (Ta) لزوج من البادئات تجريبيًا عن طريق إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل المتدرج (PCR). يُرجى استخدام حاسبة Tm من NEB لتحديد درجة حرارة التلدين الأولية لزوج البادئات وبوليميراز/محلول NEB المستخدم. على عكس الحاسبات الأخرى، تأخذ حاسبة Tm من NEB في الاعتبار مكونات المحلول التي تؤثر على درجات حرارة الانصهار والملاحظات التجريبية عند حساب درجة حرارة التلدين المثلى. قد تُقلل الحاسبات الأخرى عبر الإنترنت من تقدير أفضل درجة حرارة تلدين لبوليميراز Q5. لمزيد من المعلومات حول استخدام درجة حرارة تلدين واحدة (أي "عالمية")، يُرجى الاطلاع على مذكرتنا التطبيقية: درجة حرارة التلدين العالمية في تفاعل البلمرة المتسلسل وتأثيرها على نتائج التضخيم. يُعد تفاعل البلمرة المتسلسل الفعال عملية توازن ديناميكية بين المواد الكيميائية والمتفاعلات التي تُعزز التفاعل المحدد للبادئ مع مُكمله في القالب عند درجة حرارة التلدين المُختارة. بينما تُعدّ درجات حرارة التلدين قيمًا ثابتة يختارها العالم، فإن درجات حرارة الانصهار بين كل بادئ وقالب الحمض النووي قد تختلف من مُضخّم لآخر. ملاحظة: يتناول هذا القسم تحديدًا تلدين بادئ أوليغونوكليوتيد بقالب الحمض النووي. خلال مرحلة التمسخ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، تفصل درجة الحرارة العالية قالب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) إلى حمض نووي أحادي السلسلة (ssDNA)، كاشفةً عن تسلسلات نيوكليوتيدية معقدة تسمح بتلدين (ارتباط، تهجين، اقتران) بادئ أوليغونوكليوتيد أحادي السلسلة مُكمّل عند درجة حرارة أقل. درجة حرارة التلدين (TA) هي درجة الحرارة المستخدمة خلال مرحلة تلدين البادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل، وهي تعتمد على درجة حرارة انصهار البادئ. درجة حرارة انصهار البادئ (TM) هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها 50% من البادئ بمُكمّله المثالي، بينما يكون 50% منه حرًا في المحلول نتيجةً لانفصاله ("انصهاره") عن مُكمّله. لماذا يُعدّ استخدام درجة حرارة التلدين الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية لنجاح تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ عادةً ما تكون درجة حرارة التلدين أقل من درجة حرارة الانصهار لضمان تهجين البادئ مع القالب. إذا كانت درجة حرارة التلدين مرتفعة جدًا، فلن يرتبط البادئ بالقالب ولن تتم عملية التضخيم. أما إذا كانت منخفضة جدًا، فقد يحدث ارتباط غير نوعي للبادئ (أو البادئات) بالقالب أو ببعضها البعض (ثنائيات البادئات)، مما يؤدي إلى: زيادة احتمالية تكوين نواتج غير نوعية، وانخفاض تكوين الناتج المطلوب بسبب ظروف التفاعل غير الفعالة. تؤثر متفاعلات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على درجة حرارة انصهار البادئ ودرجة حرارة التلدين. لا تُعدّ درجات حرارة الانصهار قيمًا ثابتة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، بل تتأثر بعدد من العوامل، منها: طول البادئ ونسبة الجوانين والسيتوزين إلى الأدينين والثايمين (نسبة محتوى GC)، والتي تحدد مقدار الروابط الهيدروجينية بين البادئ ومكمله. كلما زادت الروابط الهيدروجينية (ارتفاع درجة انصهار) البادئ مع قالبه، زادت الطاقة اللازمة لكسر هذه الروابط (ارتفاع درجة الحرارة). تركيز البادئ: تُحدد درجة انصهار البادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بواسطة نوع الحمض النووي الموجود بوفرة مولية، والذي ينبغي أن يكون البادئات. المغنيسيوم والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs): يُحدد التركيز الحر لأيونات المغنيسيوم [Mg2+] درجة انصهار الحمض النووي المزدوج، ولكن يمكن للمغنيسيوم أن يُحتجز بواسطة المتفاعلات والنواتج في تفاعل البلمرة المتسلسل. ترتبط الشحنة الموجبة للمغنيسيوم بالفوسفات سالبة الشحنة في النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات والبادئات والحمض النووي أحادي السلسلة. يؤدي تقليل التنافر الكهروستاتيكي (بين البادئ وفوسفات الحمض النووي أحادي السلسلة) إلى زيادة تركيز البادئات. تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ (Na+، K+): تدعم الكاتيونات أحادية التكافؤ استقرار الحمض النووي المزدوج، على غرار أيونات المغنيسيوم. تتنافس الكاتيونات أحادية التكافؤ وأيونات المغنيسيوم على الارتباط بالحمض النووي. يؤدي زيادة تركيز الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى تقليل ارتباط المغنيسيوم بالحمض النووي. س: ما هي خصائص هذا البوليميراز (الدقة، نهايات المنتج، الحد الأقصى للتضخيم، دمج القاعدة المعدلة، إلخ)؟ أ: دقة منتجات البوليميراز* معدل الخطأ نهايات المنتج أقصى طول للمنتج** درجة حرارة التمديد دمج النيوكليوتيدات المعدلة*** دمج اليوراسيل إكسونوكلياز 5´-3´ 3´-5´ (تدقيق لغوي) إكسونوكلياز بوليميراز Q5 280X <0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC، 6mA لا (باستثناء Q5U) - ++++ بوليميراز فيوجن 39-50X 0.44 × 10-6 طرف غير حاد 20 كيلوبايت بسيط، 10 كيلوبايت معقد 72 درجة مئوية 5mC، 5hmC لا - ++++ بوليميراز ون تاك 2X <140 × 10-6 3´A/blunt 6kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + ++ بوليميراز Taq 1X 2.85 x 10^-4 3´A 5kb 68°C 5mC, 5hmC, biotin, DIG نعم + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2kb 68°C نعم لا - بوليميراز LongAmp® 2X 3´A/blunt 30kb 65°C لا نعم ++ *الدقة نسبةً إلى بوليميراز Taq DNA. نواصل البحث في المقايسات لتوصيف معدل الخطأ المنخفض جدًا لـ Q5 لضمان تقديم بيانات الدقة الأكثر دقةً الممكنة (Potapov, V, and Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **تشمل القوالب البسيطة البلازميدات والفيروسات والحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية. وتشمل القوالب المعقدة الحمض النووي الجينومي للنباتات والبشر والثدييات الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي المكمل (cDNA). *** لمزيد من المعلومات، تواصل مع الدعم الفني عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. لمزيد من المعلومات حول الخصائص التي تساعدك في اختيار بوليميراز مناسب لتطبيقك، يُرجى الاطلاع على مخطط اختيار بوليميراز الحمض النووي. تعرّف على المزيد حول الدقة ومعدل الخطأ: تُعرَّف دقة بوليميراز الحمض النووي بقدرته على نسخ القالب بدقة، بينما يُعرَّف معدل الخطأ بأنه معدل إدخال نيوكليوتيد غير مطابق بشكل صحيح. تُعد الدقة مهمة للتطبيقات التي يجب أن يكون فيها تسلسل الحمض النووي صحيحًا بعد التضخيم. لمعرفة المزيد حول كيفية قياس الدقة، انقر هنا. نهايات المنتج ونشاط الإكسونوكلياز: اطّلع على قسم "تعرّف على المزيد" في الأسئلة الشائعة حول نهايات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والأسئلة الشائعة حول نشاط الإكسونوكلياز لبوليميرازات الحمض النووي. س: نتائجي ليست كما هو متوقع. أين يمكنني العثور على مساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟ أ: تضخيم غير نوعي، أو عدم حدوث تضخيم، أو حجم ناتج غير صحيح. هل لديك نتيجة غير متوقعة؟ راجع دليل استكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وإصلاحها بعد انتهاء التفاعل لتحديد الأسباب المحتملة للنتائج غير المتوقعة والحلول. يمكنك الاطلاع على المزيد من التفاصيل حول ظروف التفاعل وتحسين الإعداد في إرشاداتنا لتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المحبة للحرارة، وفي هذه المدونة. يسعد فريق الدعم الفني دائمًا بمساعدتك في استكشاف أخطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل وإصلاحها. إذا كنت ترغب في الحصول على مساعدة، يمكنك: مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على info@neb.com، أو الاتصال بالدعم الفني على الرقم (800)-0632-7799، متاح من الاثنين إلى الجمعة، من الساعة 9:00 صباحًا حتى 6:00 مساءً بتوقيت شرق الولايات المتحدة، أو ملء هذا النموذج الإلكتروني. فشل تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت: إذا كنت تواجه صعوبة في تضخيم هدف أكبر من 5 كيلوبايت، فجرب بعض هذه النصائح: نوصي باستخدام بوليميراز Q5® أو Phusion® أو LongAmp®. إذا كنت تستخدم Q5، فحاول تقليل تركيز البادئ النهائي إلى 150-300 نانومتر. تتيح تركيبات الإنزيم والمحلول المنظم المستقلة مرونة أكبر في تحسين التفاعل مقارنةً بالخلطات الرئيسية. استخدم المزيد من القالب. تعامل مع القالب المنقى برفق حتى لا يتلف. حسّن تركيز الإنزيم عن طريق اختبار معايرة الإنزيم في التفاعل (0.25-2 وحدة/50 ميكرولتر من التفاعلات). زد عدد الدورات. أطل وقت التمديد إلى 40 ثانية/كيلوبايت. التلطيخ على هلام الأغاروز: عند عدم توفر الظروف المثلى لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، غالبًا ما تُلاحظ لطخة أو مستوى عالٍ من الخلفية. جرّب واحدًا أو أكثر من الاقتراحات التالية: استخدم كمية أقل من الإنزيم. خفّض درجة حرارة التمديد بمقدار 3 درجات مئوية عن درجة حرارة التمديد الموصى بها في بروتوكول المنتج المحدد. على سبيل المثال، يوصي بروتوكول OneTaq® بدرجة حرارة تمديد 68 درجة مئوية؛ جرّب 65 درجة مئوية. ارفع درجة حرارة التلدين. جرّب بروتوكولات دورات ثنائية الخطوات. إذا ظهرت هالة مضيئة حول البئر بالإضافة إلى اللطخة من البئر، فاستخدم كمية أقل من القالب.