نيو إنجلاند بيولابس، M0537L، بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0®

هذا المنتج متوفر بصيغة خالية من الجلسرين. الفئات ذات الصلة: التضخيم متساوي الحرارة وتطبيقات إزاحة السلسلة، تضخيم إزاحة السلسلة وإنزيم القطع، تضخيم الجينوم الكامل، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 25 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. شروط التفاعل: عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة، حضانة عند 65 درجة مئوية. عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة: 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 50 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Tween® 20 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.1 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شروط فحص الوحدة : 50 ملي مولار KCl، 20 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.8)، 10 ملي مولار MgCl2، 30 نانومولار M13mp18 SS DNA، 70 نانومولار بادئ تسلسل M13 (–47) 24 قاعدة، 200 ميكرومول من dATP، 200 ميكرومول من dCTP، 200 ميكرومول من dGTP، 100 ميكرومول من dTTP بما في ذلك [3H]-dTTP و100 ميكروغرام/مل من BSA. الأسئلة الشائعة : س: هل يتم تزويد بوليميرازات الحمض النووي NEB بـ dNTPs؟ ج: لا، يجب طلب dNTPs بشكل منفصل. يمكن طلبها كمزيج جاهز (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0447) بتركيز 10 مليمول من كل ديوكسي نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب فردية (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0446) بتركيز 100 مليمول من كل ديوكسي نيوكليوتيد). س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 في محاليل NEBuffer الأخرى؟ ج: يُلاحظ النشاط الأمثل في محلول التضخيم متساوي الحرارة، ويُلاحظ أداء شبه مثالي في محلول تفاعل ThermoPol™. تم اختبار الوحدة في محلول غير مثالي مأخوذ من المراجع العلمية. يُظهر الإنزيم نشاطًا بنسبة 25% في محلول NEBuffer 1، ونشاطًا بنسبة 100% في المحاليل 2 و3 و4 وEcoRI. يُنصح بإضافة 0.1% من Triton X-100 أو 0.1% من Tween-20 أو 100 ميكروغرام/مل من BSA إلى محاليل NEBuffer من 1 إلى 4 للحصول على أفضل النتائج. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® لإزالة النهايات غير المتداخلة؟ ج: يمكن ملء النهايات 5' المتدلية (النهايات 3' المتراجعة)، ولكن لن تتم إزالة النهايات 3' المتدلية لأن الإنزيم يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز. إنزيم بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210) هو الإنزيم الأمثل لهذا التطبيق. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® لملء النهايات المتدلية 3'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي ملء النهايات المتدلية 3'. لإنشاء نهايات غير لاصقة، يجب إزالة النهايات المتدلية 3'. يُعد كل من بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210)، وبوليميراز الحمض النووي T4 (NEB# M0203)، ونوكلياز فول المونج (NEB# M0250) أفضل الخيارات لإزالة النهايات المتدلية 3'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® لإزالة النهايات المتدلية 5'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي إزالة النهايات المتدلية 5'. استخدم نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) لإزالة النهايات المتدلية 5'. س: هل يمكن تعطيل إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® بالحرارة؟ ج: نعم، يُسخّن عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يمكن استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في التطبيقات التي تتطلب دورات حرارية؟ ج: لا، درجات حرارة التفاعل مرتفعة جدًا بالنسبة لاستقرار الإنزيم. س: هل يمكن لإنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® أن يبدأ من شق في الحمض النووي؟ ج: نعم، يمكنه بدء تخليق السلسلة من الشق باستخدام مجموعة OH في الطرف 3' كبادئ. س: هل يمكن استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في تفاعلات الوسم وتفاعلات التعبئة الجزئية؟ ج: نعم، يُوصى أيضًا باستخدام جزء كلينو (3'→5' exo-) (NEB #M0212) لهذه التطبيقات. س: هل يمكن تخفيف إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0®؟ ج: نعم، يمكن تخفيفه وتخزينه في محلول منظم يحتوي على 0.1% من Triton X-100 أو 100 ميكروغرام/مل من BSA. المحلول المنظم المفضل هو 50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و10 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.5)، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT، و0.1% من Triton X-100، و50% من الجلسرين. يمكن أيضًا استخدام المخفف A مع rAlbumin (NEB# B8532). س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في درجات حرارة أخرى غير 65 درجة مئوية؟ ج: نعم، يتمتع الإنزيم بالفعالية التالية: 10-15% عند 37 درجة مئوية، 30-50% عند 50 درجة مئوية، 100% عند 60-70 درجة مئوية، 30-50% عند 72 درجة مئوية. لا يُنصح باستخدام Bst 2.0 عند درجات حرارة أعلى من 72 درجة مئوية لأنه يُصبح غير فعال بالحرارة. س: هل يُدمج بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® dUTP؟ ج: نعم. يُمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® مع خليط من dUTP وdTTP أو مع استبدال dTTP بـ dUTP بالكامل. قد يُؤدي استخدام dUTP بنسبة 100% إلى تثبيط تفاعلات Bst 2.0 (انخفاض يصل إلى الضعف في زمن عتبة التضخيم)، ولكن يبقى الأداء قويًا. المرجع: Kuangwen Hsieh, Peter L. Mage, Andrew T. Csordas, Michael Eisenstein, H. Tom Soh. (2014). التخلص المتزامن من التلوث المتبقي والكشف عن الحمض النووي باستخدام تضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة مُدعم بإنزيم يوراسيل-دي إن إيه-جليكوزيلاز (UDG-LAMP). الجمعية الملكية للكيمياء. PubMedID: 24577617. س: هل يحتوي بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® على إكسونوكلياز نشط للتدقيق من 3' إلى 5'؟ ج: لا. س: هل يتمتع بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® بنشاط النسخ العكسي؟ ج: نعم. لاستخدامه في تطبيقات النسخ العكسي، نوصي بتركيزات عالية من المغنيسيوم (حوالي 8 ملي مولار). يُظهر Bst 2.0 تباينًا أكبر في التضخيم مع قوالب الحمض النووي الريبي، حيث تعمل بعض مجموعات البادئات بكفاءة أعلى من غيرها. للحصول على تفاعلات نسخ عكسي أكثر قوة واتساقًا، نوصي باستخدام إنزيم نسخ عكسي مُخصص، ولكن يُوصى باستخدام Bst 2.0 وحده لتطبيقات الإنزيم الواحد على الرغم من أنه قد يلزم تحسينه. س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نُقدّم خياراتٍ مُتعددة لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغةً فلوريةً مُركّزةً 50X للكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. أما مجموعة WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA وRNA) (NEB #M1800) فتتضمن مُؤشّرًا لونيًا يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغيّر اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). تتضمن الإصدارات المُحدّثة من كلا المنتجين إنزيم UDG وdUTP غير المُستقر حراريًا لتقليل خطر التلوث المُتبقّي (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، فإن مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) متوافق مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تحتوي جميع مزيجات LAMP الرئيسية على مزيج من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart لتضخيم سريع وقوي من كل من أهداف الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. لا يتطلب كل مزيج سوى بادئات LAMP وعينات الحمض النووي DNA أو الحمض النووي الريبي RNA التي يوفرها المستخدم. س: كيف أستخدم إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لمنع التلوث المتبقي في تفاعلات LAMP؟ ج: يتطلب منع التلوث المتبقي جزأين: دمج dUTP بواسطة بوليميراز الحمض النووي DNA أثناء تكوين الأمبليكون، واستئصال اليوراسيل في المنتجات المضخمة وتدمير الأمبليكون المحفز بواسطة إنزيم UDG. في تفاعلات LAMP، يُنصح بإجراء التفاعلات مع إضافة حوالي 50% من dUTP ممزوجًا بـ dTTP (مثل 1.4 ملي مولار من dATP، dCTP، dGTP، و0.7 ملي مولار من dTTP وdUTP)، ويُفضل استخدام بوليميراز DNA من نوع Bst لضمان دمج dU بكفاءة دون تثبيط ملحوظ للتفاعل. وللتخلص من النواتج الملوثة، يُوصى بشدة باستخدام إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي بدلاً من إنزيم UDG الأكثر استقرارًا حراريًا من الإشريكية القولونية. أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP، ثم قم بإعداد وتشغيل تفاعلات LAMP كالمعتاد. سيعمل نشاط إنزيم UDG أثناء الإعداد والتسخين إلى 65 درجة مئوية على تدمير أي نواتج ملوثة بسرعة وكفاءة. في حال الحاجة إلى تطهير أكثر دقة، يُمكن إضافة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في بداية خطوات العمل. لتبسيط الأمر، تم تضمين dUTP وUDG في مجموعة محدثة من: WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix مع UDG ومجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG). س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart® ومتى أستخدمها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير نوعي. ماذا تعني Hot Start/WarmStart؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® لدينا أبتاميرات تثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يمنع تكوين منتجات غير نوعية. لا يؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين Hot Start وWarmStart هو أن إنزيمات Hot Start محبة للحرارة بينما إنزيمات WarmStart® محبة للحرارة المعتدلة؛ النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات لإنزيمات Hot Start وWarmStart متشابه إلى حد كبير. الأبتاميرات هي جزيئات قليلة النوكليوتيدات مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد عبر تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تكمن ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا يُطلق عليها اسم "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0®؟ ج: يمكن أن تؤدي درجات الحرارة التي تتجاوز 72 درجة مئوية إلى انخفاض ملحوظ في نشاط الإنزيم. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي عدم استخدام المحلول المنظم المناسب الذي يحتوي على 0.1% من Triton X-100 أو 0.1% من Tween-20 أو 100 ميكروغرام/مل من BSA إلى فشل التفاعل. انظر السؤال 3 أعلاه. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ ج: تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه الطريقة بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق مميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. يوفر LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام أجهزة قياس فورية وعالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) بإضافة بسيطة لإنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يُجرى تفاعل RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة في خطوة واحدة. إن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه للحمض النووي الريبوزي (RNA) مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، مما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتفاعل RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. سؤال: ما الفرق بين بوليميراز Bst DNA، والقطعة الكبيرة، وBst 2.0، وBst 3.0، وبوليميراز Bst-XT DNA؟ أ: جميع البوليميرازات الأربعة هي بوليميرازات DNA متوسطة الثبات الحراري، تتميز بنشاط إزاحة السلسلة، مما يُمكّنها من إجراء تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة مثل LAMP. يُعد بوليميراز Bst 2.0 DNA نظيرًا مُصممًا حاسوبيًا لبوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير. وقد صُمم لتحسين خصائصه في تفاعلات LAMP، بما في ذلك تحمل الملوحة، والثبات الحراري، ودمج dUTP. يتميز Bst 2.0 بخصوصيته العالية. يُقدم Bst 3.0 بعض التحسينات على Bst 2.0، وأبرزها سرعة التضخيم. كما يتميز Bst 3.0 بأداء مُحسّن في تفاعلات LAMP ذات درجات الحرارة العالية (حتى 72 درجة مئوية)، إلا أنه بالنسبة لبعض الأهداف، لا يحتفظ Bst 3.0 بخصوصية Bst 2.0 العالية. يجمع Bst-XT بين أفضل خصائص Bst 2.0 وBst 3.0. يتميز هذا المنتج بالدقة العالية لـ Bst 2.0 وسرعة التضخيم العالية لـ Bst 3.0. كما أن Bst-XT فعال ضمن نطاق أوسع من درجات الحرارة، مما يتيح إجراء تفاعلات LAMP بين 50 و70 درجة مئوية. Bst-XT WarmStart NEB #M9204، Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538، Bst 3.0 NEB #M0374. سرعة التضخيم: ★★★★★ ★★★ ★★★★★. الدقة: ★★★★★ ★★★★★ ★★. هل يمكن إعداده في درجة حرارة الغرفة؟ مُفعّل مُفعّل غير مُوصى به درجة حرارة LAMP المثلى 50-70 درجة مئوية 60-70 درجة مئوية 55-72 درجة مئوية متوفر خالي من الجلسرين نعم NEB #M9205 نعم NEB #M0402 نعم NEB #M0443 ★★★★★ = المنتج الأمثل والموصى به للتطبيق المحدد ★★ أو ★★★ = سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد ★ = قد يؤدي الغرض ولكن لا يُوصى به س: متى يجب أن يكون إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® هو الإنزيم المُختار؟ ج: يُظهر إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 نشاطًا عاليًا في إزاحة السلسلة. إنه يملأ فجوة بين البوليميرازات المحبة للحرارة والبوليميرازات المحبة للحرارة المعتدلة. تُعدّ درجة الحرارة المثلى التي تتراوح بين 60 و70 درجة مئوية أعلى من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210)، وأقل من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي فينت (NEB# M0254)، وهما بوليميرازان آخران يعملان على إزاحة السلسلة. يتيح هذا للباحثين نطاقًا أوسع من ظروف التفاعل لتحسين إزاحة السلسلة وربط البادئات. يُعدّ هذا مفيدًا في تصميم استراتيجيات التسلسل، بالإضافة إلى تقنيات التضخيم متساوي الحرارة. تُسهّل درجة حرارة التفاعل المرتفعة التسلسل عبر المناطق الغنية بالـ GC. س: لماذا أستخدم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart®؟ ج: يوفر بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart® جميع الخصائص المحسّنة لاستخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0، مع ميزة إضافية تتمثل في إمكانية إعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة. تُظهر بوليميرازات الحمض النووي نشاطًا غير مرغوب فيه وغير مُوجّه عند درجات حرارة أقل من درجات حرارة التضخيم المُحدّدة، ويمكن أن يؤثر هذا النشاط بشكل كبير على الأداء وقابلية التكرار. يعمل الأبتامر الموجود في Bst 2.0 WarmStart® على تثبيط نشاط بوليميراز الحمض النووي عند درجة حرارة أقل من 45 درجة مئوية، وبالتالي يمكن إعداد التفاعلات في درجة حرارة الغرفة.