نيو إنجلاند بيولابس، M0538L، بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart®

هذا المنتج متوفر في الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، تضخيم إزاحة السلسلة وإنزيم القطع، تضخيم الجينوم الكامل، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 25 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. شروط التفاعل: عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة، حضانة عند 65 درجة مئوية. عبوة واحدة من محلول التضخيم متساوي الحرارة: 20 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار (NH4)2SO4، 50 ملي مولار KCl، 2 ملي مولار MgSO4، 0.1% Tween® 20 (الأس الهيدروجيني 8.8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1% Triton® X-100، الأس الهيدروجيني 7.1 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. شروط فحص الوحدة : 50 ملي مولار KCl، 20 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.8)، 10 ملي مولار MgCl2، 30 نانومولار M13mp18 SS DNA، 70 نانومولار بادئ تسلسل M13 (–47) 24 قاعدة، 200 ميكرومول من dATP، 200 ميكرومول من dCTP، 200 ميكرومول من dGTP، 100 ميكرومول من dTTP بما في ذلك [3H]-dTTP و100 ميكروغرام/مل من BSA. الأسئلة الشائعة : س: هل يتم تزويد بوليميرازات الحمض النووي NEB بـ dNTPs؟ ج: لا، يجب طلب dNTPs بشكل منفصل. يمكن طلبها كمزيج جاهز (مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0447) بتركيز 10 مليمول من كل ديوكسي نيوكليوتيد) أو كمجموعة من 4 أنابيب فردية (مجموعة محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB# N0446) بتركيز 100 مليمول من كل ديوكسي نيوكليوتيد). س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 في محاليل NEBuffer الأخرى؟ ج: يُلاحظ النشاط الأمثل في محلول التضخيم متساوي الحرارة، ويُلاحظ أداء شبه مثالي في محلول تفاعل ThermoPol™. تم اختبار الوحدة في محلول غير مثالي مأخوذ من المراجع العلمية. يُظهر الإنزيم نشاطًا بنسبة 25% في محلول NEBuffer 1، ونشاطًا بنسبة 100% في المحاليل 2 و3 و4 وEcoRI. يُنصح بإضافة 0.1% من Triton X-100 أو 0.1% من Tween-20 أو 100 ميكروغرام/مل من BSA إلى محاليل NEBuffer من 1 إلى 4 للحصول على أفضل النتائج. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® لإزالة النهايات غير المتداخلة؟ ج: يمكن ملء النهايات 5' المتدلية (النهايات 3' المتراجعة)، ولكن لن تتم إزالة النهايات 3' المتدلية لأن الإنزيم يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز. إنزيم بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210) هو الإنزيم الأمثل لهذا التطبيق. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® لملء النهايات المتدلية 3'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي ملء النهايات المتدلية 3'. لإنشاء نهايات غير لاصقة، يجب إزالة النهايات المتدلية 3'. يُعد كل من بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210)، وبوليميراز الحمض النووي T4 (NEB# M0203)، ونوكلياز فول المونج (NEB# M0250) أفضل الخيارات لإزالة النهايات المتدلية 3'. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® لإزالة النهايات المتدلية 5'؟ ج: لا، لا تستطيع بوليميرازات الحمض النووي إزالة النهايات المتدلية 5'. استخدم نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) لإزالة النهايات المتدلية 5'. س: هل يمكن تعطيل إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® بالحرارة؟ ج: نعم، يُسخّن عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يمكن استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في التطبيقات التي تتطلب دورات حرارية؟ ج: لا، درجات حرارة التفاعل مرتفعة جدًا بالنسبة لاستقرار الإنزيم. س: هل يمكن لإنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® أن يبدأ من شق في الحمض النووي؟ ج: نعم، يمكنه بدء تخليق السلسلة من الشق باستخدام مجموعة OH في الطرف 3' كبادئ. س: هل يمكن استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في درجات حرارة أخرى غير 65 درجة مئوية؟ ج: نعم، يتمتع الإنزيم بالفعالية التالية: 10-15% عند 37 درجة مئوية، 30-50% عند 50 درجة مئوية، 100% عند 60-70 درجة مئوية، 30-50% عند 72 درجة مئوية. لا يُنصح باستخدام Bst 2.0 عند درجات حرارة أعلى من 72 درجة مئوية لأنه يفقد فعاليته بالحرارة. س: هل يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® في تفاعلات الوسم وتفاعلات التعبئة الجزئية؟ ج: نعم، يُوصى أيضًا باستخدام جزء كلينو (3'→5' exo-) (NEB #M0212) لهذه التطبيقات. س: هل يمكن تخفيف بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0®؟ ج: نعم، يمكن تخفيفه وتخزينه في محلول منظم يحتوي على 0.1% من Triton X-100 أو 100 ميكروغرام/مل من BSA. المحلول المنظم المفضل هو 50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و10 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.5)، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT، و0.1% من Triton X-100، و50% من الجلسرين. يمكن أيضًا استخدام المخفف A مع الألبومين المؤتلف (NEB# B8532). س: هل يحتوي بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® على إكسونوكلياز نشط للتدقيق من 3' إلى 5'؟ ج: لا. س: هل يدمج بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® dUTP؟ ج: نعم. يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® مع خليط من dUTP وdTTP أو مع استبدال dTTP بالكامل بـ dUTP. قد يؤدي استخدام 100% من dUTP إلى تثبيط تفاعلات Bst 2.0 (انخفاض يصل إلى الضعف في زمن عتبة التضخيم)، ولكن يظل الأداء قويًا. المرجع: كوانغوين هسيه، بيتر إل. ماج، أندرو تي. كسورداس، مايكل أيزنشتاين، إتش. توم سوه. (2014). التخلص المتزامن من التلوث المتبقي والكشف عن الحمض النووي باستخدام تضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة مُدعم بإنزيم يوراسيل-دي إن إيه جليكوزيلاز (UDG-LAMP). الجمعية الملكية للكيمياء. PubMedID: 24577617. س: هل لدى NEB مزيج رئيسي لتفاعلات LAMP أو RT-LAMP؟ ج: نعم. نقدم عدة خيارات لدعم بروتوكولات LAMP/RT-LAMP. تتضمن مجموعة WarmStart® LAMP (DNA وRNA) (NEB #E1700) صبغة فلورية LAMP بتركيز 50X لدعم الكشف الفلوري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP. يحتوي مزيج WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) (NEB #M1800) على مؤشر لوني يعتمد على الرقم الهيدروجيني للكشف البصري عن تفاعلات LAMP/RT-LAMP (يشير تغير اللون من الوردي إلى الأصفر إلى التضخيم). تتضمن الإصدارات المُحدثة من كلا المنتجين إنزيم UDG وdUTP غير المستقرين حراريًا لتقليل خطر التلوث المتبقي (NEB #E1708 وNEB #M1804 على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، يتوافق مزيج WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) (NEB #M1708) مع أنواع مختلفة من عينات الإدخال ويدعم طرق كشف متعددة، بما في ذلك هيدروكسي نافثول الأزرق. تحتوي جميع مزيجات LAMP الرئيسية على مزيج من إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx وإنزيم بوليميراز الحمض النووي WarmStart Bst 2.0 لتضخيم سريع وفعال من كل من أهداف الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA. لا يتطلب كل مزيج سوى بادئات LAMP التي يوفرها المستخدم وعينات الحمض النووي DNA أو RNA المستهدفة. س: كيف أستخدم إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لمنع التلوث المتبقي في تفاعلات LAMP؟ ج: يتطلب منع التلوث المتبقي جزأين: دمج dUTP بواسطة بوليميراز الحمض النووي DNA أثناء تكوين الأمبليكون، واستئصال اليوراسيل من المنتجات المُضخّمة وتدمير الأمبليكون بواسطة إنزيم UDG. بالنسبة لتفاعلات LAMP، يجب إجراء التفاعلات مع إضافة حوالي 50% من dUTP ممزوجًا بـ dTTP (مثل 1.4 مليمولار من dATP، dCTP، dGTP، 0.7 مليمولار من dTTP وdUTP)، ويجب استخدام بوليميراز الحمض النووي Bst لدمج dU بكفاءة دون تثبيط ملحوظ للتفاعل. لتدمير المنتجات الملوثة لاحقًا، يُوصى بشدة باستخدام إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي بدلاً من إنزيم UDG الأكثر استقرارًا حراريًا من الإشريكية القولونية. أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم UDG المقاوم للحرارة في القطب الجنوبي لكل 25 ميكرولتر من تفاعل LAMP، ثم قم بإعداد وتشغيل تفاعلات LAMP كالمعتاد. سيعمل إنزيم UDG أثناء الإعداد والتسخين إلى 65 درجة مئوية على تدمير أي منتجات ملوثة بسرعة وكفاءة. إذا لزم تطهير أكثر دقة، فيمكن إضافة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في بداية سير العمل. ولتبسيط الأمر، تم تضمين dUTP وUDG في مجموعة WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix مع UDG ومجموعة WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG). س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل باستخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0®؟ ج: يمكن أن تؤدي درجات الحرارة التي تزيد عن 72 درجة مئوية إلى تقليل نشاط الإنزيم بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي عدم استخدام المحلول المنظم المناسب الذي يحتوي على 0.1% من Triton X-100، أو 0.1% من Tween-20، أو 100 ميكروغرام/مل من BSA إلى فشل التفاعل. انظر السؤال 3 أعلاه. س: ما هي بوليميرازات Hot Start وWarmStart®، ومتى أستخدمها؟ ج: عند تحضير تفاعلات درجة حرارة الغرفة بعيدًا عن الجليد، وعند ملاحظة تضخيم غير نوعي. ما المقصود بـ Hot Start/WarmStart؟ تستخدم بوليميرازات Hot Start وWarmStart® لدينا أبتاميرات تثبط نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة، مما يمنع تكوين نواتج غير نوعية. لا يؤثر وجود هذه الأبتاميرات على وظيفة الإنزيم الأساسية. الفرق بين Hot Start وWarmStart هو أن إنزيمات Hot Start محبة للحرارة، بينما إنزيمات WarmStart® محبة للحرارة المعتدلة؛ ويتشابه النطاق الديناميكي الحراري للأبتاميرات الخاصة بإنزيمات Hot Start وWarmStart إلى حد كبير. الأبتاميرات هي جزيئات قليلة النوكليوتيدات مصممة هندسيًا ترتبط بجزيء هدف محدد عبر تفاعلات غير تساهمية، وتتضمن تعديلات محددة على قواعد النوكليوتيدات لتحسين خصائص التثبيط و/أو تقليل الآثار الجانبية غير المقصودة. تكمن ميزة التثبيط القائم على الأبتاميرات مقارنةً بتقنيات البدء الساخن الأخرى (مثل الأجسام المضادة) في أنها لا تتطلب خطوة تنشيط، وترتبط بشكل عكسي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة. توفر شركة NEB بوليميرازات مزودة بأبتاميرات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة، والتضخيم متساوي الحرارة، والنسخ العكسي. يمكن لهذه الأبتاميرات استهداف وظائف إنزيمية مختلفة لبوليميرازات مختلفة. للمزيد من المعلومات، لماذا يُطلق عليها اسم "البدء الساخن"؟ مثل العديد من بوليميرازات الحمض النووي من عائلة A غير المُدققة، يمتلك بوليميراز Taq القدرة على إضافة قواعد إلى نهاية الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطريقة مستقلة عن القالب حتى في درجة حرارة الغرفة، مما قد يؤدي إلى إضافة قواعد غير محددة إلى نهايات بادئات الحمض النووي في التفاعل، مما يسمح بالتهجين خارج الهدف ويقلل من خصوصية التفاعل الإجمالية. في المقابل، عند درجات حرارة أعلى، يقل الارتباط غير المحدد مع ازدياد صرامة عملية التلدين. ركزت الطرق المبكرة للتخفيف من النشاط غير المرغوب فيه عند درجات الحرارة المنخفضة على استبعاد مكونات التفاعل الرئيسية حتى يتم رفع درجة حرارة التفاعل، والتي يمكن إضافتها بعد ذلك إلى الخليط، مما يؤدي إلى بدء التفاعل في ظل ظروف أكثر تقييدًا ودرجة حرارة عالية. اقرأ مقالنا المميز، "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده"، للاطلاع على بيانات تقارن تكوين المنتج للإنزيمات مع وبدون تثبيط النشاط القائم على الأبتاميرات. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ أ: تضخيم الحمض النووي المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. تستخدم هذه الطريقة بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق متميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الحمض النووي المستهدف) مع نتائج سريعة: يمكن إجراء التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام القياس في الوقت الحقيقي وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث يتم إجراء RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه بواسطة RNA، مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وهو ما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا الخاصة بتقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما الفرق بين بوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير، وBst 2.0، وBst 3.0، وبوليميراز Bst-XT DNA؟ ج: جميع البوليميرازات الأربعة هي بوليميرازات DNA متوسطة الثبات الحراري، تتميز بنشاط إزاحة السلسلة، مما يُمكّنها من إجراء تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة مثل LAMP. يُعد بوليميراز Bst 2.0 DNA نظيرًا مُصممًا حاسوبيًا لبوليميراز Bst DNA، الجزء الكبير. وقد صُمم لتحسين خصائصه في تفاعلات LAMP، بما في ذلك تحمل الملوحة، والثبات الحراري، ودمج dUTP. يتميز إنزيم Bst 2.0 بدقة عالية. ويُقدم إنزيم Bst 3.0 بعض التحسينات على Bst 2.0، أبرزها سرعة تضخيم أعلى. كما يتميز Bst 3.0 بأداء مُحسّن في تفاعلات LAMP عند درجات حرارة أعلى (تصل إلى 72 درجة مئوية)، إلا أنه لا يحتفظ بدقة Bst 2.0 العالية لبعض الأهداف. أما إنزيم Bst-XT فيجمع بين أفضل خصائص Bst 2.0 وBst 3.0، حيث يوفر دقة Bst 2.0 العالية وسرعة تضخيم Bst 3.0 العالية. كما يتميز Bst-XT بنشاطه ضمن نطاق أوسع من درجات الحرارة، مما يُتيح إجراء تفاعلات LAMP بين 50 و70 درجة مئوية. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 سرعة التضخيم ★★★★★ ★★★ ★★★★★ الخصوصية ★★★★★ ★★★★★ ★★ إعداد درجة حرارة الغرفة؟ مُفعّل مُفعّل غير مُوصى به درجة حرارة LAMP المثلى 50-70 درجة مئوية 60-70 درجة مئوية 55-72 درجة مئوية متوفر خالي من الجلسرين نعم NEB #M9205 نعم NEB #M0402 نعم NEB #M0443 ★★★★★ = المنتج الأمثل والموصى به للتطبيق المحدد ★★ أو ★★★ = سيؤدي الغرض في التطبيق المحدد ★ = قد يؤدي الغرض ولكن لا يُوصى به س: متى يجب أن يكون إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0® هو الإنزيم المُختار؟ ج: يُظهر إنزيم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 نشاطًا عاليًا في إزاحة السلسلة. إنه يملأ فجوة بين البوليميرازات المحبة للحرارة والبوليميرازات المحبة للحرارة المعتدلة. تُعدّ درجة الحرارة المثلى التي تتراوح بين 60 و70 درجة مئوية أعلى من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي الأول، الجزء الكبير (كلينو) (NEB# M0210)، وأقل من درجة حرارة بوليميراز الحمض النووي فينت (NEB# M0254)، وهما بوليميرازان آخران يعملان على إزاحة السلسلة. يتيح هذا للباحثين نطاقًا أوسع من ظروف التفاعل لتحسين إزاحة السلسلة وربط البادئات. يُعدّ هذا مفيدًا في تصميم استراتيجيات التسلسل، بالإضافة إلى تقنيات التضخيم متساوي الحرارة. تُسهّل درجة حرارة التفاعل المرتفعة التسلسل عبر المناطق الغنية بالـ GC. س: لماذا أستخدم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart®؟ ج: يوفر بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 WarmStart® جميع الخصائص المحسّنة لاستخدام بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0، مع ميزة إضافية تتمثل في إمكانية إعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة. تُظهر بوليميرازات الحمض النووي نشاطًا غير مرغوب فيه وغير مُوجّه عند درجات حرارة أقل من درجات حرارة التضخيم المُحدّدة، ويمكن أن يؤثر هذا النشاط بشكل كبير على الأداء وقابلية التكرار. يعمل الأبتامر الموجود في Bst 2.0 WarmStart® على تثبيط نشاط بوليميراز الحمض النووي عند درجة حرارة أقل من 45 درجة مئوية، وبالتالي يمكن إعداد التفاعلات في درجة حرارة الغرفة.