نيو إنجلاند بيولابس، M0550S، بوليميراز الحمض النووي الريبي من الإشريكية القولونية، الإنزيم الأساسي

إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA)، الإنزيم الأساسي، يتكون من 5 وحدات فرعية تُسمى α، α، β´، β، وω. الفئات ذات الصلة: تخليق الحمض النووي الريبي (RNA)، النسخ في المختبر (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات للحمض النووي الريبي (RNA) . تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لدمج 1 نانومول من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTP) في الحمض النووي الريبي (RNA) خلال 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي لبكتيريا الإشريكية القولونية بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي لبكتيريا الإشريكية القولونية بتركيز 1X: 40 ملي مولار من Tris-HCl، 150 ملي مولار من KCl، 10 ملي مولار من MgCl2، 1 ملي مولار من DTT، 0.01% من Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين : 20 ملي مولار من Tris-HCl، 100 ملي مولار من NaCl، 0.1 ملي مولار من EDTA، 1 ملي مولار من DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. شروط فحص الوحدة : محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي لبكتيريا الإشريكية القولونية بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من كل نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات، وعامل سيجما 70، و1 ميكروغرام من الحمض النووي لفيروس T7 في 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA) في الإشريكية القولونية، والإنزيم الأساسي، والإنزيم الكامل؟ ج: يتكون الإنزيم الأساسي لبوليميراز الحمض النووي الريبي في الإشريكية القولونية من 5 وحدات فرعية تُسمى α، α، β'، β، وω. هذا الإنزيم خالٍ من عامل سيجما، ولا يبدأ عملية النسخ من محفزات الحمض النووي البكتيري أو العاثي. مع ذلك، يحتفظ الإنزيم بقدرته على نسخ الحمض النووي الريبي من تسلسلات بدء غير محددة. إضافة عوامل سيجما تُمكّن الإنزيم من بدء تخليق الحمض النووي الريبي من محفزات بكتيرية وعاثية محددة. يبلغ الوزن الجزيئي للإنزيم الأساسي حوالي 400 كيلو دالتون. أما الإنزيم الكامل لبوليميراز الحمض النووي الريبي في الإشريكية القولونية، فهو الإنزيم الأساسي مُشبع بعامل سيجما 70. يبدأ هذا الإنزيم الكامل تخليق الحمض النووي الريبي من محفزات بكتيرية وعاثية محددة لعامل سيجما 70. س: ما هي الوظائف الرئيسية لهذه الوحدات الفرعية؟ ج: الوظائف الرئيسية للوحدات الفرعية هي: تحتوي الوحدة الفرعية β' على جزء من المركز النشط المسؤول عن تخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA). تحتوي الوحدة الفرعية β على الجزء المتبقي من المركز النشط المسؤول عن تخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA). توجد الوحدة الفرعية α بنسختين لكل جزيء من بوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RNA Polymerase). تحتوي الوحدة الفرعية α على محددات لتجميع بوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RNA Polymerase) وللتفاعلات مع العوامل التنظيمية. تُسهّل الوحدة الفرعية ω الصغيرة تجميع بوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RNA Polymerase) وتُثبّت بوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RNA Polymerase) المُجمّع. تعمل عوامل سيجما، عند ارتباطها بالإنزيم الأساسي، على زيادة الخصوصية لمُحفّزاته وتسمح ببدء النسخ في المواقع الصحيحة. س: هل يُمكن استخدام الإنزيم الأساسي والإنزيم الكامل في PURExpress؟ ج: نعم. إذا كان جينك يحتوي على مُحفّز سيجما 70 قوي، فيُمكن ترجمته في PURExpress بإضافة الإنزيم الكامل إلى التفاعل. إذا كان جينك خاضعًا لسيطرة عوامل سيجما أخرى، فيجب عليك استخدام الإنزيم الأساسي وعامل سيجما المحدد. وقد استخدمت شركة NEB بنجاح عامل سيجما 54 والإنزيم الأساسي في PURExpress. س: ما هي عوامل سيجما الأخرى في بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: بالإضافة إلى عامل سيجما 70 "الأساسي"، تشمل عوامل سيجما الأخرى في بكتيريا الإشريكية القولونية ما يلي: σ19 (FecI) - عامل سيجما سترات الحديديك، الذي ينظم جين fec لنقل الحديد. σ24 (RpoE) - عامل سيجما خارج السيتوبلازم/الإجهاد الحراري الشديد. σ28 (RpoF) - عامل سيجما السوط. σ32 (RpoH) - عامل سيجما الصدمة الحرارية، الذي يتم تنشيطه عند التعرض للحرارة. σ38 (RpoS) - عامل سيجما مرحلة الجوع/الثبات. σ54 (RpoN) - عامل سيجما المحدد للنيتروجين.