نيو إنجلاند بيولابس، M0554S، مزيج إنزيم KLD

الفئات ذات الصلة: مجموعات تجميع الحمض النووي، والاستنساخ، والطفرات. التطبيقات: الطفرات الموجهة للموقع، الطفرات الموجهة للموقع، حلول الاستنساخ عالي الإنتاجية والأتمتة. المواصفات : المواد المطلوبة (غير متوفرة ): ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة: س: هل مزيج KLD (NEB#M0554) هو نفس منتج مكونات مجموعات Q5 للطفرات الموجهة للموقع (E0554S وE0552S)؟ ج: نعم. مزيج KLD هو نفس منتج مكون KLD في مجموعات Q5 للطفرات الموجهة للموقع. س: ما هي البوليميرازات التي يمكن استخدامها لتضخيم القطع التي سيتم فسفرتها وربطها بواسطة مزيج KLD؟ ج: يُستخدم مزيج KLD مع القطع التي تم تضخيمها باستخدام بوليميراز Q5 عالي الدقة أو بوليميراز Phusion عالي الدقة. هذا المنتج غير مناسب لتضخيم الحمض النووي ذي النهايات المتدلية 3' (مثل: تضخيم Taq). لا نوصي باستخدام هذا المنتج على قطع الحمض النووي التي تم تضخيمها بواسطة بوليميرازات أخرى. س: هل أحتاج إلى تنقية قطع الحمض النووي المُضخمة بتقنية PCR قبل أو بعد معالجتها بمزيج KLD؟ ج: لا. تنقية قطع الحمض النووي المُضخمة بتقنية PCR غير ضرورية. س: ما هو مزيج KLD؟ ج: يحتوي مزيج KLD على مزيج من إنزيمات الكيناز والليغاز وDpnI في محلول منظم يحافظ على نشاط الإنزيمات. تسمح هذه التركيبة بالفسفرة الفعالة، والربط/التكوير داخل الجزيء، وإزالة القالب في خطوة تفاعل واحدة مدتها 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. س: إذا ضاعفت حجم تفاعل PCR، فهل يجب إضافة المزيد من مزيج PCR إلى تفاعل KLD؟ ج: لا. تم تصميم مزيج إنزيم KLD بتركيز 10X ليعمل بكفاءة مع 1 ميكرولتر من مزيج PCR بغض النظر عن حجم تفاعل PCR. س: هل يمكنني استخدام أكثر من 5 ميكرولتر من تفاعل KLD لتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: لا. إذا لزم استخدام أكثر من 5 ميكرولتر من تفاعل KLD، فيجب إجراء خطوة تبديل المحلول المنظم، مثل تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، قبل التحويل. س: هل يمكن حضانة تفاعل KLD لفترة أطول أو في درجة حرارة أعلى؟ ج: يمكن حضانة تفاعل KLD لمدة تصل إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلاً من ذلك، لزيادة كفاءة هضم DpnI، يمكن حضانة تفاعل KLD في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، تليها 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تُعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة ضرورية لنشاط إنزيمات الكيناز والليغاز. س: أستخدم مجموعة Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit لإدخال طفرات مفردة. كيف يمكنني إدخال طفرات متعددة؟ ج: طورت شركة NEB® بروتوكولًا باستخدام NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتبسيط عملية بناء الطفرات الموجهة متعددة المواقع. تتضمن هذه التقنية تصميم بادئات جانبية متكاملة لمحاذاة القطع. تشرح هذه المذكرة التطبيقية استخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix لتوليد طفرات موجهة متعددة في مواقع مختلفة في آن واحد. نوصي بتداخل يتراوح بين 18 و20 نيوكليوتيد، ولكن يمكن تغيير طول البادئات. تتداخل البادئات تمامًا كما هو موضح أدناه. الهدف هو تحقيق توازن في قيم Ta لأزواج البادئات. تقع الطفرات في منتصف البادئة. يجب أن يكون هناك عدد كافٍ من القواعد على كلا الجانبين، والأهم من ذلك، في الطرف 3' من الطفرة، حتى ترتبط البادئة بشكل صحيح بالقالب.