نيو إنجلاند بيولابس، M0568S، إكسونوكلياز I غير مستقر حرارياً

هل أنت مهتم ببروتوكول مدته 5 دقائق؟ جرب Exo-CIP الفئات ذات الصلة الإكسونوكليازات والإندونيوكليازات غير النوعية المواصفات الوحدة التعريف وحدة واحدة من الإكسونوكلياز الحراري غير المستقر I تُعرَّف بأنها كمية الإنزيم التي تحفز إطلاق 2 نانومول من النيوكليوتيد القابل للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 100 ميكرولتر في 6 دقائق عند 37 درجة مئوية في 50 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.9)، 100 ملي مولار NaCl، 10 ملي مولار MgCl2 و100 ميكروغرام/مل BSA مع 0.17 مليغرام/مل من الحمض النووي أحادي السلسلة [3H]- E. coli. شروط التفاعل: حضانة محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. محلول التخزين: 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 0.25 مولار كلوريد الصوديوم، 50% جلسرين، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مصل البقر (BSA)، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة . شروط فحص الوحدة : 50 ملي مولار Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 7.9)، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مصل البقر (BSA)، و0.17 مليغرام/مل من حمض نووي ريبوزي أحادي السلسلة. [3H]- حمض نووي من الإشريكية القولونية. الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكنني إزالة البادئات والنيوكليوتيدات المتبقية من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) قبل تسلسل الحمض النووي؟ ج: في البروتوكول المعتاد، يمكن مزج 5 ميكرولتر من ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (من 30-35 دورة PCR)، و1 ميكرولتر من إنزيم إكسونوكلياز I غير المستقر حراريًا، و1 ميكرولتر من محلول Quick CIP (لا حاجة لإضافة محلول rCutSmart Buffer)، ثم حضانة المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لتعطيل الإنزيم. يُحفظ ناتج التنظيف عند -20 درجة مئوية قبل التسلسل. يُستخدم 3 ميكرولتر من ناتج التنظيف لتسلسل سانجر. س: هل يستطيع إنزيم إكسونوكلياز I غير المستقر حراريًا إزالة البادئات في تفاعلات البلمرة المتسلسل المتداخلة؟ ج: نعم، أضف 1 ميكرولتر من إنزيم إكسونوكلياز I غير المستقر حراريًا إلى نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للجولة الأولى (حتى 20 ميكرولتر) وحضّن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لتعطيل الإنزيم. بعد ذلك، يمكن إضافة مجموعات جديدة من البادئات، ثم إجراء جولة ثانية من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتقليل نواتج التضخيم غير النوعية. س: هل يُحلل إنزيم إكسونوكلياز I غير المستقر حراريًا الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: لا، الحمض النووي الريبي (RNA) ليس ركيزة لإنزيم إكسونوكلياز I غير المستقر حراريًا عند استخدامه وفقًا للتوصيات. س: هل يمكن استخدام إنزيم إكسونوكلياز I غير المستقر حراريًا لإزالة النهايات غير المتداخلة للحمض النووي المزدوج (dsDNA)؟ ج: لا، النهايات القصيرة للحمض النووي المفرد (ssDNA) ليست ركيزة له. استخدم بوليميراز الحمض النووي الأول، جزء كلينو الكبير (NEB# M0210) لملء النتوءات 5′ وإزالة النتوءات 3′، أو استخدم نوكلياز فول المونج (NEB# M0250) لإزالة النتوءات 3′ أو 5′. ملاحظة: لا يمكن ملء النتوءات 3′. س: هل يمكن تعطيل الإكسونوكلياز الأول غير المستقر حراريًا؟ ج: نعم. عطّل الإنزيم بالحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، أو 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. س: هل يمكن استخدام الإكسونوكلياز الأول غير المستقر حراريًا مع إكسونوكلياز مزدوج السلاسل لتنظيف مستحضرات البلازميد؟ ج: لا يُنصح بذلك. أفضل إنزيم لتنظيف تلوث الحمض النووي الجينومي في مستحضرات البلازميد هو الإكسونوكلياز الخامس (recBCD، NEB #M0345). س: هل يعمل الإكسونوكلياز الأول غير المستقر حراريًا في محاليل منظمة أخرى؟ ج: نعم، أدى التحضين لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية في المحاليل التالية إلى إزالة أكثر من 95% من الأوليغومرات (20 بيكومول من الحمض النووي أحادي السلسلة 20 قاعدة): المحاليل، نسبة الأوليغومرات المُزالة: محلول تفاعل Taq القياسي > 95%، محلول تفاعل LongAmp® Taq > 95%، محلول تفاعل OneTaq® القياسي > 95%، محلول التضخيم متساوي الحرارة > 95%، محلول تفاعل Thermopol > 95%، محلول تفاعل Epimark® Hot Start Taq > 95%، محلول تفاعل Q5® > 95%، محلول AmpliTaq® 360 (Gold) > 95%، محلول Phusion® HF > 95%، محلول تفاعل Green GoTaq® > 95%، محلول NEBuffer® r1.1 > 95%، محلول NEBuffer r2.1 > 95%، محلول NEBuffer r3.1 > 95% محلول rCutSmart™ > 95% س: هل يمكن استخدام إكسونوكلياز I مع إكسونوكلياز ثنائي السلاسل لتنظيف مستحضرات البلازميد؟ ج: يمكن استخدام إكسونوكلياز I مع إكسونوكلياز لامدا (NEB# M0262) لتنظيف مستحضرات البلازميد. كما يمكن استخدام إكسونوكلياز III (NEB# M0206) وإكسونوكلياز T7 (NEB# M0263)، ولكنهما قد يُتلفان البلازميدات المقطوعة. على الرغم من إمكانية استخدام إكسونوكلياز I، فإننا نوصي باستخدام إكسونوكلياز V (RecBCD) (NEB #M0345) لإزالة الحمض النووي الصبغي بعد تحضير البلازميد (راجع ملاحظة التطبيق الخاصة بنا: استخدام إكسونوكلياز V (RecBCD) للتخلص من الحمض النووي الجينومي المتبقي عند تنقية البلازميدات منخفضة النسخ باستخدام مجموعة Monarch® Plasmid Miniprep Kit). س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسر شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري المصل (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المؤتلف (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المؤتلف. الألبومين المعاد تركيبه. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية هو خطوة في الاتجاه الصحيح، ونحن قادرون على تقديم هذا التحسين بنفس السعر.