نيو إنجلاند بيولابس، M0608S، إنزيم إزالة غطاء mRNA

إنزيم إزالة غطاء mRNA يزيل غطاء m الفئات ذات الصلة مواصفات تعديل الحمض النووي الريبي تعريف الوحدة يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية إنزيم إزالة غطاء mRNA المطلوبة لتحويل 50٪ من ركيزة m7 ذات غطاء G بتركيز 500 نانومتر إلى شكل أحادي الفسفرة 5' في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل إنزيم إزالة غطاء mRNA بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل إنزيم إزالة غطاء mRNA بتركيز 1X: 50 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار كلوريد الأمونيوم، 5 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار DTT، 0.1% بولوكسامر 188 (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 300 ملي مولار NaCl، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري : لا. الأسئلة الشائعة: س: هل يزيل إنزيم إزالة غطاء mRNA ثلاثي الفوسفات من الطرف 5′؟ ج: نعم، ولكن بكفاءة أقل. في ظل ظروف تفاعل قياس الوحدة، تطلّب الأمر عشرة أضعاف كمية الإنزيم اللازمة لتحويل ركيزة RNA ثلاثية الفوسفات المكونة من 25 نيوكليوتيدًا إلى شكل أحادي الفوسفات بنسبة 10% مقارنةً بالكمية اللازمة لإزالة غطاء 5′ من نفس الركيزة المكونة من 25 نيوكليوتيدًا. أما زيادة كمية الإنزيم بمقدار 100 ضعف فلم تُحقق سوى 50% من التحويل. يُعدّ إنزيم RppH (NEB #M0356) خيارًا أفضل لتحويل ثلاثي الفوسفات إلى أحادي الفوسفات. س: هل نشاط إنزيم إزالة غطاء mRNA حساس للبنية الثانوية للـ RNA؟ ج: نعم. تُزال غطاءات النهايات 5′ المتراجعة أو غير المتداخلة بكفاءة أقل من النهايات أحادية السلسلة أو النهايات 5′ المتدلية. مع ذلك، يمكن التغلب على التداخل البنيوي باستخدام كمية أكبر من الإنزيم، أو درجات حرارة حضانة أعلى، أو فترات حضانة أطول. س: هل يُفضّل إنزيم إزالة غطاء mRNA RNA الأطول أم الأقصر؟ ج: لم يُظهر إنزيم إزالة غطاء mRNA تفضيلات واضحة للـ RNA الطويل أو القصير. عندما تتساوى كميات نهايات الحمض النووي الريبوزي (RNA)، تتم إزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي (RNA) من جزيء مكون من 25 نيوكليوتيدًا وجزيء آخر بطول 1.7 كيلوبايت بنفس الكفاءة. س: هل إنزيم إزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) فعال في محاليل تفاعل NEB الأخرى؟ ج: إنزيم إزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) فعال بنسبة 50% تقريبًا في محلول rCutSmart®، ومحلول NEBuffer r1.1، ومحلول ThermoPol™. س: هل يتطلب إنزيم إزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) وجود معادن لكي يكون فعالًا؟ ج: نعم، المغنيسيوم ضروري لعملية إزالة الغطاء. س: هل إنزيم إزالة غطاء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) فعال في درجات حرارة أعلى؟ ج: نعم. يُلاحظ نشاط إزالة الغطاء الكامل حتى 45 درجة مئوية، ويُلاحظ انخفاض النشاط بنسبة تزيد عن 50% حتى 55 درجة مئوية. يجب الحرص على تقليل فترات الحضانة في درجات الحرارة المرتفعة لتجنب تحلل الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعتمد على المعادن.