نيو إنجلاند بيولابس، M0616S، إنزيم إزالة مثيل الحمض النووي الريبي FTO

الفئات ذات الصلة: تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) لتقنية Illumina، مواصفات تعديل الحمض النووي الريبوزي (RNA) . تعريف الوحدة: ينتج عن تفاعل حجمه 25 ميكرولتر في محلول تفاعل FTO يحتوي على 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لـ Cluc المُعدَّل N6A بطول 1700 نيوكليوتيد، و0.5 ميكروغرام من إنزيم FTO RNA Demethylase، بعد حضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية، إزالة مثيلة لأكثر من 50% من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الركيزة، كما تم تحديده بواسطة LCMS. شروط التفاعل: 50 ملي مولار Tris HCl، درجة الحموضة 7.5، 1 ملي مولار αKG، 1 ملي مولار أسكوربات الصوديوم، 75 ملي مولار FE(II). يُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 50% جليسرول، 0.1 ملي مولار TCEP. التثبيط الحراري : لا. الوزن الجزيئي الظاهري : 59104.73 غ/مول. شروط اختبار الوحدة: يُحضن 1 ميكروغرام من إنزيم FTO RNA Demethylase مع 100 نانوغرام من ركيزة Cluc mRNA (1766 قاعدة؛ 100% m6A)، و50 ملي مولار Tris HCl، درجة الحموضة 7.5، و1 ملي مولار αKG، و1 ملي مولار أسكوربات الصوديوم، و75 ميكرومولار Fe(II) في حجم تفاعل 25 ميكرولتر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم يُعالج التفاعل بـ 0.8 وحدة من بروتينيز K، درجة بيولوجيا جزيئية (P8107) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يُنقى الحمض النووي الريبوزي (RNA) الناتج باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch® (T2040)، ثم يُهضم إلى نيوكليوسيدات باستخدام مزيج هضم النيوكليوسيدات (M0649). يُحدد مدى إزالة مجموعة الميثيل من m6A بمراقبة أنواع الأدينوزين المختلفة على جهاز كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء (UHPLC) من نوع Agilent 1290 Infinity II، مزود بكاشف مصفوفة ثنائية G7117A وكاشف مطياف الكتلة 6135 XT، على عمود Waters XSelect HSS T3 XP (2.1 × 100 مم، 2.5 ميكرومتر)، باستخدام طور متحرك متدرج مكون من الميثانول ومحلول أسيتات الأمونيوم بتركيز 10 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 4.5). تُؤكد هوية كل قمة بواسطة مطياف الكتلة. تُحدد الوفرة النسبية لكل نيوكليوسيد بتكامل كل قمة عند 260 نانومتر أو أقصى امتصاص للأشعة فوق البنفسجية. الأسئلة الشائعة : س: هل توجد أي نواتج hm6A وf6A غير متفاعلة في نهاية تفاعل إنزيم FTO RNA Demethylase؟ ج: نعم، يتم الكشف عن حوالي 20% من hm6A وحوالي 10% من f6A في نهاية تفاعل إنزيم FTO RNA Demethylase مع 100 نانوغرام من ركيزة Cluc mRNA (1766 نيوكليوتيد؛ 100% m6A). س: ما هو نشاط إنزيم FTO RNA Demethylase في محاليل NEB الأخرى؟ ج: يُعد محلول Tris HCl، بدرجة حموضة 7.5، والمُضاف إليه 1 ملي مولار من αKG، و1 ملي مولار من L-Asc، و75 ميكرومولار من Fe(II) هو المحلول الأمثل لتفاعل إنزيم FTO RNA Demethylase (86% تحويل m6A). ينتج عن النشاط النسبي لإنزيم FTO RNA Demethylase مع محاليل NEB المُدعّمة بـ 1 ملي مول من αKG، و1 ملي مول من L-Asc، و75 ميكرومول من Fe(II)، النسبة المئوية التالية لتحويل m6A. المحلول، النسبة المئوية للتحويل: 50 ملي مول من Tris HCl، درجة الحموضة 7.5، 86؛ محلول rCutSmart™، 24؛ محلول NEBuffer، 1.1، 73؛ محلول NEBuffer، 2.1، 24؛ محلول NEBuffer، 3.1، 4. س: ما هي إنزيمات الابتكار؟ ج: إنزيمات الابتكار (EFI) هو مشروع أطلقته شركة NEB لتوفير إنزيمات فريدة للمجتمع العلمي، على أمل تمكين اكتشاف تطبيقات جديدة ومبتكرة. تتميز هذه الإنزيمات بخصائص مثيرة للاهتمام وتخصصات فريدة غير متوفرة تجاريًا في أي مكان آخر بالجودة التي تتوقعها من NEB. إنزيمات الابتكار المتخرجة هي إنزيمات انتقلت من تطبيقات غير معروفة أو استكشافية إلى أن أصبحت حجر الزاوية في تطبيق محدد. إذا كانت لديك فكرة عن "إنزيم للابتكار" مع تطبيق مقترح قد يكون مفيدًا، يُرجى مراسلتنا عبر البريد الإلكتروني على EnzymesForInnovation@neb.com. لمزيد من المعلومات، يُرجى مشاهدة الفيديو.