نيو إنجلاند بيولابس، M0647S، إنزيم ربط الحمض النووي عالي الدقة Taq

هذا المنتج متوفر في فئات ذات صلة: تطبيقات ربط الحمض النووي، ربط غير استنساخي، مواصفات ربط الحمض النووي، شروط التفاعل: محلول تفاعل ربط الحمض النووي HiFi Taq بتركيز 1X، محلول تفاعل ربط الحمض النووي HiFi Taq بتركيز 1X، 20 ملي مولار Tris-HCl، 150 ملي مولار KCl، 10 ملي مولار MgCl2، 10 ملي مولار DTT، 1 ملي مولار NAD، 0.1% Triton® X-100 (الأس الهيدروجيني 8.5 عند 25 درجة مئوية) ، محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% Triton® X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية ، التعطيل الحراري: لا ، الأسئلة الشائعة : س: ما هي أفضل استخدامات ربط الحمض النووي HiFi Taq؟ ج: تم تصميم إنزيم HiFi Taq DNA Ligase للاستخدام في طرق الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) عن طريق الربط، مثل تفاعل سلسلة الربط (LCR) وتفاعل الكشف عن الربط (LDR). في هذه الطرق، يمكن الكشف عن وجود قاعدة معينة في موقع واحد من خلال مجسات تلتقي بالقاعدة الطرفية لأحد المجسات مع القاعدة المراد تحليلها. إذا شكلت القاعدة الطرفية زوجًا قاعديًا من نوع واتسون-كريك مع القالب في هذا الموضع، فسيربط الإنزيم المجسين. أما إذا لم تتحد القاعدة الطرفية، فلن يربط الإنزيم المجسين. ولأن الإنزيم مقاوم للحرارة، يمكن تكرار التفاعل وتضخيم نواتج الربط. لمزيد من المعلومات حول خصوصية الإنزيم وإنزيمات الربط عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في إنزيمات ربط الحمض النووي". س: هل يمكن استخدام محلول HiFi Taq DNA Ligase مع إنزيمات ربط الحمض النووي الأخرى؟ ج: نعم، يمكن استخدام محلول HiFi Taq DNA Ligase مع إنزيم Taq DNA Ligase. استخدام محلول HiFi Taq DNA Ligase مع إنزيم Taq DNA Ligase سيؤدي إلى زيادة طفيفة في الدقة والنشاط. إنزيمات الربط المعتمدة على ATP (مثل 9°N™ DNA Ligase NEB #M0238، وT4 DNA Ligase NEB #M0202، وT7 DNA Ligase NEB #M0318) غير متوافقة مع هذا المحلول. لمزيد من المعلومات حول خصوصية إنزيمات الربط وإنزيمات الربط عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في إنزيمات ربط الحمض النووي". سؤال: هل يمكن استخدام HiFi Taq DNA Ligase في محاليل أخرى؟ جواب: لتحقيق أعلى دقة ممكنة مع HiFi Taq DNA Ligase، نوصي باستخدام محلول HiFi Taq DNA Ligase، ومع ذلك، يمكن استخدام HiFi Taq DNA Ligase في محلول Taq DNA Ligase مع انخفاض في النشاط والدقة. يمكن استخدام إنزيم HiFi Taq DNA Ligase في مجموعة متنوعة من محاليل البوليميراز عند إضافة 1 ملي مولار من NAD، مما يؤدي إلى انخفاض النشاط وانخفاض طفيف في الدقة. محلول NEB، نشاط إنزيم HiFi Taq DNA Ligase (%)، التأثير على الدقة، محلول HiFi Taq DNA Ligase 100 - محلول Taq DNA Ligase 38 ↓↓↓، محلول تفاعل phi29 1 54 ↓↓، محلول تفاعل Q5® 1 73 ↓، محلول تفاعل Standard Taq 1 90 ↓، محلول ThermoPol® 1 215 ↓↓. 1- مُضاف إليه 1 ملي مولار من NAD. 2- قد تؤدي إضافة 5 ملي مولار من المغنيسيوم إلى محاليل البوليميراز إلى زيادة نشاط إنزيم HiFi Taq DNA Ligase، ولكنها قد تقلل الدقة بشكل أكبر. س: ما هي درجة حرارة التفاعل المثلى لإنزيم HiFi Taq DNA Ligase؟ ج: إنزيم HiFi Taq DNA Ligase نشط ضمن نطاق واسع من درجات الحرارة (35-75 درجة مئوية)، مع زيادة ملحوظة في النشاط عند درجات حرارة أعلى تصل إلى درجة انصهار (Tm) جزيئات الحمض النووي المستخدمة. يمكن إجراء عمليات الربط النموذجية عند 60 درجة مئوية. من الأفضل اختيار درجة حرارة التفاعل بناءً على درجة انصهار (Tm) جزيئات الحمض النووي المستخدمة، بحيث تكون قريبة جدًا منها، محسوبة وفقًا لظروف المحلول المنظم (10 ملي مولار MgCl2، 150 ملي مولار KCl) وتركيزات الجزيئات المستخدمة. يجب تحديد درجة حرارة التفاعل المثلى لتطبيق معين تجريبيًا. س: ما كمية إنزيم HiFi Taq DNA Ligase المطلوبة للتفاعل؟ ج: يستخدم التفاعل النموذجي 1 ميكرولتر من إنزيم HiFi Taq DNA Ligase في حجم تفاعل 50 ميكرولتر. يرجى مراجعة معلومات المنتج المرفقة للاطلاع على تفاصيل ظروف التفاعل، بما في ذلك النسب المولية للجزيئات، والحمض النووي المستهدف، والإنزيم. س: كم عدد دورات درجة الحرارة التي يتحملها إنزيم HiFi Taq DNA Ligase؟ ج: يبقى إنزيم HiFi Taq DNA Ligase نشطًا بنسبة تزيد عن 97% بعد أكثر من 100 دورة (حيث الدورة الواحدة = 80 درجة مئوية لمدة 90 ثانية، و94 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ). س: هل يمكن استخدام إنزيم HiFi Taq DNA Ligase للاستنساخ؟ ج: لا، إنزيم HiFi Taq DNA Ligase لا يربط جميع أنواع النهايات. نوصي باستخدام إنزيم T4 DNA Ligase (NEB #M0202) للاستنساخ. س: هل يتطلب إنزيم HiFi Taq DNA Ligase وجود NAD+؟ ج: نعم. قد تُلاحظ آثار ضئيلة من النشاط في المحاليل المنظمة الخالية من NAD+ بسبب وجود عامل مساعد مرتبط مسبقًا بالإنزيم. س: ما مدى استقرار إنزيم HiFi Taq DNA Ligase عند 95 درجة مئوية؟ ج: يبلغ نصف عمر إنزيم HiFi Taq DNA Ligase أكثر من 90 دقيقة عند 95 درجة مئوية. س: ما مدى استقرار إنزيم HiFi Taq DNA Ligase في درجة حرارة الغرفة؟ ج: لأكثر من أسبوع. س: لماذا يكون لون محلول HiFi Taq DNA Ligase بنيًا؟ ج: يتفاعل DTT وNAD ويتحول لونهما إلى البني. سيظل المحلول البني فعالًا. س: هل تقوم إنزيمات ربط الحمض النووي المقاومة للحرارة (مثل Taq DNA Ligase و9°N DNA Ligase وHiFi Taq DNA Ligase) بربط النهايات اللزجة؟ ج: على الرغم من قدرة هذه الإنزيمات المقاومة للحرارة على ربط النهايات اللزجة ذات التداخل الواسع، مثل النهايات المتماسكة ذات 12 زوجًا قاعديًا في جينوم العاثية لامدا، إلا أن النهايات البارزة النموذجية ذات 4 أزواج قاعدية الناتجة عن إنزيمات التقييد من النوع الثاني ليست ركائز جيدة ولن يتم ربطها. لا يُنصح باستخدام إنزيمات ربط الحمض النووي المقاومة للحرارة في عمليات الاستنساخ التقليدية. س: هل لإنزيم HiFi Taq DNA Ligase نشاط على الركائز التي تحتوي على الحمض النووي الريبي (RNA)؟ ج: لا يعمل إنزيم HiFi Taq DNA Ligase إلا على ركائز الحمض النووي المقطوعة التي لا تحتوي على أي عدم تطابق أو فجوات. لا يُظهر إنزيم HiFi Taq DNA Ligase أي نشاط قابل للقياس على الحمض النووي الريبي (RNA) أو ركائز الحمض النووي الريبي/الحمض النووي (RNA/DNA) المُقطّعة. س: ما هو تفاعل الكشف عن الربط (LDR) وكيف يختلف عن تفاعل الربط المتسلسل (LCR)؟ ج: تفاعل الكشف عن الربط (LDR) هو منهجية تعتمد على الربط، وعلى عكس تفاعل الربط المتسلسل (LCR)، فإنه يتضمن زوجًا واحدًا فقط من المجسات المُكملة لأحد خيوط الحمض النووي المستهدف. ينتج عن تكرار تفاعل LDR تضخيم خطي لناتج الربط. يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد وجود تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) في تسلسل مستهدف تم تضخيمه بطريقة أخرى (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR). كما هو الحال مع تفاعل الربط المتسلسل (LCR)، تستخدم هذه الطريقة إنزيم ربط عالي الدقة ومستقر حراريًا، قادر على التمييز ضد ربط المجسات غير المتطابقة، مثل إنزيم Taq DNA Ligase (NEB #M0208) وإنزيم 9°N™ DNA Ligase (NEB #M0238). للحصول على مزيد من المعلومات حول خصوصية الليغازات والليغازات عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في ليغازات الحمض النووي". س: ما هو تفاعل سلسلة الليغاز (LCR) وما هي الإنزيمات التي توصون بها؟ ج: تفاعل سلسلة الليغاز (LCR) هو طريقة مشابهة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الحمض النووي ولها تطبيقات تشخيصية واعدة. يعتمد تفاعل سلسلة الليغاز على الربط، ويمكنه التمييز بين تسلسلات الحمض النووي التي تختلف في نيوكليوتيد واحد فقط (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة). تُستخدم أربعة مجسات في تفاعل سلسلة الليغاز، زوج واحد مكمل لكل سلسلة في التسلسل المستهدف، مع وجود نقطة الربط عند تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة المراد التمييز بينها. تستخدم هذه الطريقة ليغازات الحمض النووي المقاومة للحرارة مثل Taq DNA Ligase (NEB #M0208) و9°N™ DNA Ligase (NEB #M0238). للحصول على مزيد من المعلومات حول خصوصية الليغازات والليغازات عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة والتمييز بين عدم التطابق في ليغازات الحمض النووي". س: كيف يُمكنني تصميم مجسات لتفاعل الكشف عن الليغاز (LDR) أو تفاعل سلسلة الليغاز (LCR) لتحقيق أقصى قدر من الخصوصية؟ ج: يجب تصميم مجسات تفاعل الكشف عن الليغاز (LDR) وتفاعل سلسلة الليغاز (LCR) بحيث تتفاعل جميعها ضمن نطاق حراري ضيق (مثاليًا أقل من 2 درجة مئوية)، ويجب أن تحتوي على مناطق تفاعل يتراوح طولها بين 15 و30 قاعدة. عادةً، تكون درجة حرارة التفاعل المثلى للحصول على أعلى دقة تقريبًا بين درجتين مئويتين أقل ودرجتين مئويتين أعلى من درجة انصهار الليغاز (Tm) لمجموعة مجسات معينة، ويتم حسابها وفقًا لظروف المحلول المنظم المستخدم. يُوصى بشدة باستخدام حاسبة درجة حرارة تفاعل الليغاز المقاومة للحرارة لاختيار درجة حرارة الحضانة. مع ذلك، يجب تحديد درجة حرارة التفاعل المثلى لمجموعة مجسات معينة تجريبيًا. عند استخدام إنزيم HiFi Taq DNA Ligase، يمكن أن يرتبط النيوكليوتيد المفرد المتغير (SNP) المراد تمييزه إما بالقاعدة 3' للمسبار العلوي (موفرًا مجموعة الهيدروكسيل 3' لوصلة الربط) أو بالقاعدة 5' للمسبار السفلي (موفرًا مجموعة الفوسفات 5' لوصلة الربط)، حيث يُظهر إنزيم HiFi Taq DNA Ligase تمييزًا مُحسَّنًا بين أزواج القواعد الصحيحة وغير الصحيحة على جانبي وصلة الربط. يُرجى الاطلاع على معلومات المنتج المرفقة لتحليل مُفصَّل لدقة ربط عدم التطابق بواسطة إنزيم HiFi Taq DNA Ligase، والذي يُوضِّح دقته العالية على جانبي وصلة الربط 3' و5'، بالإضافة إلى نسب تمييز أزواج القواعد المُحدَّدة. لمزيد من المعلومات حول خصوصية الليغازات والليغازات عالية الدقة، يُرجى زيارة "خصوصية الركيزة وتمييز عدم التطابق في ليغازات الحمض النووي".