نيو إنجلاند بيولابس، M0649S، مزيج هضم النيوكليوسيد

مزيج هضم النيوكليوسيد هو مزيج محسن من الإنزيمات يوفر طريقة ملائمة من خطوة واحدة لتوليد نيوكليوسيدات مفردة من الحمض النووي DNA أو RNA للتحليل الكمي بواسطة كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة (LC-MS)، مما يلغي الحاجة إلى بروتوكولات الهضم المتسلسلة متعددة الخطوات والمستهلكة للوقت. الفئات ذات الصلة: الكشف عن الهيدروكسي ميثيل وتحليله، تحليل الإبيترانسكريبتوم، تحليل مثيلة الحمض النووي، مواصفات ظروف التفاعل : محلول تفاعل مزيج هضم النيوكليوزيد 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل مزيج هضم النيوكليوزيد 1X: 50 ملي مولار أسيتات الصوديوم، 1 ملي مولار كلوريد الزنك (الأس الهيدروجيني 5.4 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 1 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 2 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، 2 ملي مولار كلوريد الزنك، 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.6% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما هي أفضل استخدامات مزيج هضم النيوكليوزيد؟ ج: الاستخدام الرئيسي لمزيج هضم النيوكليوزيد هو تحديد وقياس كمية تعديلات الحمض النووي DNA وRNA (مثل المثيلة) باستخدام تحليل LC-MS. س: هل يقوم مزيج هضم النيوكليوسيدات بهضم الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)؟ ج: نعم، يقوم مزيج هضم النيوكليوسيدات بهضم الحمض النووي أحادي السلسلة إلى نيوكليوسيدات منفردة. س: هل يقوم مزيج هضم النيوكليوسيدات بهضم الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: نعم، يقوم مزيج هضم النيوكليوسيدات بهضم جزيئات الحمض النووي الريبوزي (باستثناء هياكل غطاء mRNA) إلى نيوكليوسيدات منفردة. كما يقوم مزيج هضم النيوكليوسيدات بتحليل كل من شريط الحمض النووي (DNA) وشريط الحمض النووي الريبوزي (RNA) في هجين DNA/RNA. س: هل يقوم مزيج هضم النيوكليوسيدات بهضم الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA) في هجين DNA/RNA؟ ج: نعم، يقوم مزيج هضم النيوكليوسيدات بهضم كل من شريط الحمض النووي (DNA) وشريط الحمض النووي الريبوزي (RNA) في هجين DNA/RNA إلى نيوكليوسيدات منفردة. س: ما هي كمية الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يمكن لمزيج هضم النيوكليوسيدات هضمها؟ ج: يمكن لمزيج هضم النيوكليوسيدات (1 ميكرولتر) هضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي DNA أو RNA إلى نيوكليوسيدات بكفاءة عالية خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. س: ما أنواع التعديلات فوق الجينية التي يمكن تحديدها باستخدام مزيج هضم النيوكليوسيدات؟ ج: يهضم مزيج هضم النيوكليوسيدات الأحماض النووية التي تحتوي على قواعد معدلة فوق جينياً وفوق نسخياً، مثل 5-ميثيل سيتوزين، و5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين، و5-فورميل سيتوزين، و5-كربوكسي ميثيل سيتوزين، وN6-ميثيل أدينين، و5-هيدروكسي ميثيل يوراسيل، وغيرها الكثير. كما يهضم مزيج هضم النيوكليوسيدات بعض القواعد غير الطبيعية أو التالفة. س: هل هناك أي تعديلات على الأحماض النووية لا يستطيع مزيج هضم النيوكليوسيدات هضمها؟ ج: نعم، لا يستطيع مزيج هضم النيوكليوزيدات هضم جسر 5´-ppp-5´ المقلوب (كما هو الحال في هياكل غطاء mRNA m7G-G)، أو ثنائيات الثايمين، أو فوسفات الثيوإسترات. يُظهر مزيج هضم النيوكليوزيدات فعالية منخفضة على قليل النوكليوتيدات ذات الهياكل الأساسية المعدلة بشكل كبير، والتي تحتوي على بديل واحد أو أكثر في مواقع الريبوز 2´ أو 4´ أو 5´، مثل الحمض النووي الريبوزي المضاد أو قليل النوكليوتيدات العلاجية الأخرى المصممة لمقاومة انقسام النيوكلياز. ولضمان الهضم الكامل، قد تستفيد العينات التي تحتوي على هياكل ثانوية معقدة وعدد كبير من التعديلات (خاصةً التعديلات في موقع الريبوز 2´) من حضانة ليلية مع مزيج هضم النيوكليوزيدات لتحقيق الهضم الكامل. بدلاً من ذلك، يمكن زيادة نسبة مزيج هضم النيوكليوسيد إلى الحمض النووي من 1 ميكرولتر/ميكروغرام من الركيزة إلى 5-10 ميكرولتر/ميكروغرام من الركيزة. س: هل مزيج هضم النيوكليوسيد حساس للملح؟ ج: مزيج هضم النيوكليوسيد غير حساس نسبياً لمحتوى الملح، ومع ذلك يُوصى بأن يظل تركيز الملح النهائي في تفاعل الهضم ≤ 250 ملي مولار. س: هل يهضم مزيج هضم النيوكليوسيد الحمض النووي DNA أو RNA المخزن في محلول TE؟ ج: يهضم مزيج هضم النيوكليوسيد الحمض النووي DNA أو RNA المخزن في محاليل TE النموذجية (≤ 1 ملي مولار EDTA). ما لم يكن تركيز EDTA النهائي في تفاعل الهضم > 1 ملي مولار، فليس من الضروري استبدال المحلول قبل الهضم باستخدام مزيج هضم النيوكليوسيد. س: هل من الضروري تنقية ركيزة الحمض النووي DNA/RNA قبل الهضم باستخدام مزيج هضم النيوكليوسيد؟ ج: نظرًا لأن بقايا بعض مكونات التفاعل (مثل EDTA، والمنظفات، وما إلى ذلك) قد تؤدي إلى هضم غير كامل، يُنصح بشدة بتنقية ركائز الحمض النووي DNA أو RNA (التنقية العمودية أو الاستخلاص بالفينول/الكلوروفورم متبوعًا بالترسيب بالإيثانول/الأيزوبروبانول) وإعادة تعليقها في الماء قبل هضمها باستخدام مزيج هضم النيوكليوزيد. س: هل من الضروري تنظيف خليط النيوكليوزيد المهضوم قبل تحليل LC-MS؟ ج: عادةً لا يلزم تنظيف التفاعل بعد الهضم باستخدام مزيج هضم النيوكليوزيد وقبل تحليل LC-MS. س: ما هو نشاط مزيج هضم النيوكليوزيد في محاليل منظمة أخرى؟ ج: لتحقيق أعلى فعالية ممكنة لمزيج هضم النيوكليوسيد، نوصي باستخدام محلول هضم النيوكليوسيد المرفق. مع ذلك، يتميز مزيج هضم النيوكليوسيد بفعاليته ضمن نطاق واسع من قيم الأس الهيدروجيني (الأمثل بين 4.0 و7.0)، كما أنه يتحمل الأملاح (حتى 250 ملي مولار). إضافةً إلى ذلك، ولأن مزيج هضم النيوكليوسيد يتطلب كلوريد الزنك (ZnCl2)، يجب أن يكون محلول التفاعل خاليًا من أي عوامل استخلاب (مثل EDTA) ومُضافًا إليه 1 ملي مولار من كلوريد الزنك لتحسين الفعالية في محلول آخر غير محلول تفاعل مزيج هضم النيوكليوسيد المرفق. في حين أن مزيج هضم النيوكليوسيد فعال في محلول NEBuffer r1.1 المُضاف إليه 1 ملي مولار من كلوريد الزنك، إلا أنه غير فعال في محاليل NEBuffer r2.1 وr3.1 وrCutSmart. NEBuffer r1.1 r2.1 r3.1 rCutSmart® % النشاط 100 0 0 0 س: هل يتطلب مزيج هضم النيوكليوزيد كلوريد الزنك (ZnCl2)؟ ج: نعم، يتطلب مزيج هضم النيوكليوزيد كلوريد الزنك (ZnCl2)، وبالتالي يمكن تثبيطه/تعطيله بإضافة EDTA. س: هل يمكن حضانة مزيج هضم النيوكليوزيد مع الركيزة لأكثر من ساعة؟ ج: نعم، لضمان الهضم الكامل، يمكن حضانة مزيج هضم النيوكليوزيد مع العينة لفترات زمنية أطول. لم يُلاحظ أي تدهور في الإشارة عند حضانة عينات الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) مع مزيج هضم النيوكليوزيد لفترات طويلة (طوال الليل) عند 37 درجة مئوية. قد تستفيد العينات التي تحتوي على عدد كبير من التعديلات (خاصةً التعديلات في الموضع 2') من الحضانة طوال الليل مع مزيج هضم النيوكليوزيد لتحقيق الهضم الكامل. س: لماذا يتجمد مزيج هضم النيوكليوسيد عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية؟ ج: لتقليل تأثير الجلسرين في تثبيط التأين أثناء تحليل مطياف الكتلة، صُمم مزيج هضم النيوكليوسيد ليحتوي على كمية قليلة جدًا من الجلسرين (<1%)، ولذلك يتجمد المزيج عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية. يبقى المزيج مستقرًا لأكثر من عامين عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية، ويمكنه تحمل 50 دورة تجميد وإذابة دون فقدان ملحوظ في فعاليته. س: هل يمكن تخزين مزيج هضم النيوكليوسيد في درجة حرارة 4 درجات مئوية؟ ج: نعم، يبقى المزيج مستقرًا لمدة عامين على الأقل عند تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية دون فقدان ملحوظ في فعاليته. مع ذلك، نوصي بتخزين مزيج هضم النيوكليوسيد في درجة حرارة -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد، لأنه كما هو الحال مع العديد من المحاليل المنظمة المائية، قد يؤدي التخزين طويل الأمد في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو أعلى إلى نمو البكتيريا أو الفطريات.