نيو إنجلاند بيولابس، M0650S، إنجين® سباي كاس9 نيكاز

الفئات ذات الصلة: نوكليازات CRISPR/Cas، المواصفات، شروط التفاعل: 1X NEBuffer™ r3.1، حضانة عند 37 درجة مئوية، 1X NEBuffer™ r3.1، 100 مليمولار كلوريد الصوديوم، 50 مليمولار Tris-HCl، 10 مليمولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين معاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) ، محلول التخزين: 300 مليمولار كلوريد الصوديوم، 10 مليمولار Tris-HCl، 0.1 مليمولار EDTA، 1 مليمولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية ، التعطيل الحراري : 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين EnGen® Spy Cas9 Nickase (NEB #M0650) وEnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)؟ ج: يحتوي إنزيم EnGen Spy Cas9 Nickase على طفرة نقطية واحدة (D10A) تُعطّل نطاق النيوكلياز RuvC، لكنها تُبقي نطاق النيوكلياز HNH سليمًا، مما يجعل الإنزيم نيكازًا. أما إنزيم EnGen Spy Cas9 NLS، فيحتوي على كلا نطاقي النيوكلياز نشطين، وهو قادر على قطع كلا سلسلتي الحمض النووي المزدوج. س: ما هي إشارة التوطين النووي المدمجة مع إنزيم EnGen® Spy Cas9 Nickase؟ ج: يحتوي إنزيم EnGen® Spy Cas9 Nickase على إشارة التوطين النووي (NLS) لمستضد T لفيروس SV40 على الطرفين الأميني والكربوكسيلي للبروتين. س: لماذا تختلف كفاءة الارتباط بين نوعين مختلفين من الحمض النووي الريبوزي الدليلي (guide RNA)؟ ج: قد تتأثر كفاءة الارتباط بتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليلي. تحقق من تسلسل وتصميم قالب نسخ الحمض النووي الريبوزي الدليلي. كما قد تتأثر أيضًا بجودة الحمض النووي الريبوزي الدليلي. تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليلي باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي. س: هل توفر شركة NEB جزيئات sgRNA اصطناعية أو بلازميدات للاستنساخ؟ ج: لا توفر شركة NEB خدمات تصنيع جزيئات sgRNA أو بلازميدات لاستنساخها. للاستنساخ، نوصي بزيارة موقع Addgene للحصول على بلازميدات sgRNA. وللنسخ السريع لجزيئات sgRNA دون الحاجة إلى الاستنساخ أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، نوصي باستخدام مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (E3322S). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام قوالب قليلة النوكليوتيدات التي تشفر جزيء sgRNA تحت محفز T7 (منتجات PCR أو بلازميدات) لنسخ sgRNA باستخدام مجموعة نسخ في المختبر مثل مجموعة HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit من NEB (E2050). س: كيف ينبغي توجيه جزيئات sgRNA المنزاحة لتعديلها بكفاءة باستخدام إنزيم EnGen® Spy Cas9 Nickase؟ ج: تشير التقارير المتعلقة بتعديل الجينوم باستخدام إنزيم Cas9 Nickase (D10A أو H840A) إلى أن التعديل الفعال يحدث عندما تكون جزيئات sgRNA موجهة من طرف إلى طرف (أي 5' - 5') وعندما تفصل بينها مسافة 10 و30 زوجًا قاعديًا. ينتج عن القطع في هذا الاتجاه نهايات متدلية من الطرف 5'. كان التعديل قابلاً للكشف مع أزواج sgRNA المتداخلة ومع الأزواج المتباعدة بمسافات أكبر (≥40 زوجًا قاعديًا)، وإن كان بكفاءة أقل (Ran et al. (2013) Cell, 155, 479-480). نوصي بتجربة مجموعة متنوعة من أزواج sgRNA لتحديد المجموعة التي توفر كفاءة التعديل المطلوبة. س: لماذا ألاحظ هضمًا غير مكتمل؟ ج: قد يعود عدم اكتمال الهضم إلى العوامل التالية: نسبة غير صحيحة من إنزيم Cas9 Nuclease إلى الحمض النووي الريبوزي الدليل، وموقع الهدف - للهضم الكامل، نوصي بنسبة مولية 10:10:1 أو أعلى من إنزيم Cas9 Nuclease: الحمض النووي الريبوزي الدليل: موقع الهدف. تسلسل غير مثالي للحمض النووي الريبوزي الدليل - تحقق من تسلسل وتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليل. جودة رديئة للحمض النووي الريبوزي الدليل - تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليل عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي. محلول منظم غير مثالي - يرجى استخدام محلول NEBuffer 3.1 المرفق مع الإنزيم. س: كيف أخفف الإنزيم إلى 1 ميكرومولار للتفاعلات المختبرية؟ ج: إذا كنت تخطط لاستخدام تركيز أعلى من الإنزيم للهضم المختبري للحمض النووي، فيمكن تخفيف الإنزيم إلى 1 ميكرومولار في محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X واستخدامه فورًا. يجب عدم تجميد محلول التخفيف 1 ميكرومولار في محلول NEBuffer r3.1 بتركيز 1X. إذا كان سيتم تخزين المحلول المخفف بتركيز 1 ميكرومولار عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، فيجب تخفيفه باستخدام المخفف B (مع الألبومين المؤتلف) (NEB #B8533S): 300 ميكرومولار كلوريد الصوديوم، 10 ميكرومولار Tris-HCl، 0.1 ميكرومولار EDTA، 1 ميكرومولار DTT، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مؤتلف، و50% جلسرين (الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية) قبل تحضير التفاعل. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.