نيو إنجلاند بيولابس، M0652T، علامة EnGen® Spy dCas9 SNAP

الفئات ذات الصلة: نوكليازات CRISPR/Cas، المواصفات، شروط التفاعل: 1X NEBuffer™ r3.1، حضانة عند 37 درجة مئوية، 1X NEBuffer™ r3.1، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) ، محلول التخزين: 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية، الأسئلة الشائعة : س: أين تقع إشارة التوطين النووي على SNAP dCas9 NLS، S. pyogenes؟ ج: يحتوي SNAP dCas9 NLS، S. pyogenes على إشارة توطين نووي واحدة تقع على الطرف الكربوكسيلي للبروتين. س: ما هي إشارة التوطين النووي المدمجة مع SNAP dCas9 NLS، S. pyogenes؟ ج: يحتوي SNAP dCas9 NLS، S. pyogenes على إشارة توطين نووي (NLS) لمستضد T لفيروس SV40. س: ما هي الطفرات المُعطِّلة التي أُجريت على SNAP dCas9 NLS، S. pyogenes؟ ج: يحتوي SNAP dCas9 NLS، S. pyogenes على طفرتين نقطيتين، D10A وH840A، تُعطِّلان نطاقات النيوكلياز لـ SpCas9. س: لماذا ألاحظ ارتباطًا غير كامل مع SNAP dCas9 NLS، S. pyogenes؟ ج: قد يعود عدم اكتمال الارتباط إلى العوامل التالية: نسبة غير صحيحة بين dCas9 و RNA الدليل، وموقع الهدف - للحصول على ارتباط كامل، نوصي بنسبة مولية 10:10:1 أو أعلى (SNAP dCas9 NLS : RNA الدليل : موقع الهدف). تسلسل RNA الدليل غير الأمثل - تحقق من تسلسل وتصميم RNA الدليل. جودة رديئة لـ RNA الدليل - تحقق من سلامة RNA الدليل عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي. عدم توافق المحلول المنظم - يرجى استخدام محلول NEBuffer 3.1 بتركيز 10X المرفق مع الإنزيم. س: لماذا تختلف كفاءة الارتباط بين نوعين مختلفين من RNA الدليل؟ ج: قد تتأثر كفاءة الارتباط بتصميم RNA الدليل. تحقق من تسلسل وتصميم قالب نسخ RNA الدليل. قد تتأثر أيضًا بجودة RNA الدليل. تحقق من سلامة RNA الدليل عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي. س: هل توفر NEB بلازميدات لاستنساخ sgRNA؟ ج: لا نوزع بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA)، ولكننا نوصي بزيارة موقع Addgene إذا كنت ترغب في الحصول على بلازميدات sgRNA. يمكن استخدام قوالب الحمض النووي التي تحتوي على محفز T7 وتُشفّر sgRNA مع مجموعة HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050). بالإضافة إلى ذلك، تتوفر العديد من المصادر التجارية للحمض النووي الريبوزي المرشد الاصطناعي. س: كيف أخفف الإنزيم إلى 1 ميكرومولار للتفاعلات المختبرية؟ ج: إذا كنت تخطط لاستخدام تركيز أعلى من الإنزيم لهضم الحمض النووي في المختبر، فيمكن تخفيف الإنزيم إلى 1 ميكرومولار في محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X واستخدامه فورًا. يجب عدم تجميد محلول التخفيف 1 ميكرومولار في محلول NEBuffer r3.1 بتركيز 1X. إذا كان سيتم تخزين المحلول المخفف بتركيز 1 ميكرومولار عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، فيجب تخفيفه باستخدام المخفف B (مع الألبومين المؤتلف) (NEB #B8533S): 300 ميكرومولار كلوريد الصوديوم، 10 ميكرومولار Tris-HCl، 0.1 ميكرومولار EDTA، 1 ميكرومولار DTT، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مؤتلف، و50% جلسرين (الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية) قبل تحضير التفاعل. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.