نيو إنجلاند بيولابس، M0653S، EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)

إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) هو إنزيم نووي داخلي قابل للبرمجة، يُوجَّه بواسطة جزيء واحد من الحمض النووي الريبوزي الدليل (gRNA). يتطلب الاستهداف وجود gRNA مكمل لموقع الهدف، بالإضافة إلى وحدة TTTV المجاورة للبروتوسبيسر (PAM) في الطرف 5' على شريط الحمض النووي المقابل لتسلسل الهدف. يحدث القطع بواسطة إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) على بُعد حوالي 17 قاعدة من الطرف 3' لوحدة PAM، تاركًا نهايات متدلية في الطرف 5'. الفئات ذات الصلة: نوكليازات CRISPR/Cas، المواصفات، شروط التفاعل: 1X NEBuffer™ r2.1، حضانة عند 37 درجة مئوية، 1X NEBuffer™ r2.1، 50 مليمولار كلوريد الصوديوم، 10 مليمولار Tris-HCl، 10 مليمولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين معاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) ، محلول التخزين: 500 مليمولار كلوريد الصوديوم، 20 مليمولار أسيتات الصوديوم، 0.1 مليمولار EDTA، 0.5 مليمولار TCEP-HCl، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 6 عند 25 درجة مئوية ، التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، الأسئلة الشائعة : س: ما هي الاختلافات بين EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) (NEB #M0653) وEnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)؟ ج: هناك عدد من الاختلافات بين EnGen Lba Cas12a (Cpf1) وEnGen Spy Cas9 NLS. يلخص الجدول أدناه هذه الاختلافات. EnGen Spy Cas9 NLS EnGen Lba Cas12a (Cpf1) التصنيف الفئة الثانية النوع الثاني الفئة الثانية النوع الخامس نطاقات النيوكلياز RuvC وHNH RuvC فقط الحجم 161.3 كيلو دالتون 150.9 كيلو دالتون طول الحمض النووي الريبوزي الدليل ~100 نيوكليوتيد ~41-44 نيوكليوتيد تسلسل PAM NGG TTTN موقع الانقسام 3 قواعد 5' من PAM ~18 قاعدة 3' من PAM نهايات المنتج المقطوع نهايات غير لاصقة نتوء 5' س: ما هي إشارة التوطين النووي المدمجة مع EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)؟ ج: يحتوي إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) على إشارة التوطين النووي (NLS) لمستضد T الخاص بفيروس SV40 على الطرفين الأميني والكربوكسيلي للبروتين. س: لماذا ألاحظ هضمًا محدودًا أو معدومًا باستخدام إنزيم EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)؟ ج: قد يعود الهضم غير الكامل إلى العوامل التالية: نسبة غير صحيحة بين إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) و gRNA و/أو موقع الهدف. للهضم الكامل، نوصي بنسبة مولية 10:10:1 أو أعلى من إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) : gRNA : موقع الهدف. تسلسل غير مثالي لـ gRNA. تحقق من تسلسل وتصميم gRNA. جودة رديئة لـ gRNA. تحقق من سلامة gRNA عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي. استخدام محلول منظم غير مثالي. يرجى استخدام مخفف إنزيم EnGen Lba Cas12a المرفق مع الإنزيم. عند تخفيف 100 ميكرومول من إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) لاستخدامه في فحوصات التحلل في المختبر، قد يؤدي إضافة 10 ملي مول من ثنائي ثيوثريتول (DTT) إلى تحسين تحلل الركيزة في بعض الحالات. س: هل يمكن الكشف عن الطفرات الناتجة عن إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) باستخدام إنزيم T7 Endonuclease I (NEB #M0302) أو مجموعة الكشف عن الطفرات من EnGen (NEB #E3321S)؟ ج: نعم، يمكن استخدام كلا المنتجين للكشف عن أحداث تعديل الجينوم الناتجة عن إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1). س: هل يمكن توليد الحمض النووي الريبوزي المرشد (gRNA) لاستخدامه مع إنزيم EnGen Lba Cas12a (Cpf1) باستخدام مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (NEB #E3322)؟ ج: لا، لا يمكن استخدام مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes، لإنتاج gRNAs لـ EnGen Lba Cas12a (Cpf1). إن تسلسل الحمض النووي السقالي الموجود في مزيج تفاعل sgRNA 2X، والذي يحتوي على تسلسل tracrRNA، متوافق فقط مع S. pyogenes Cas9. س: كيف أصمم RNA مرشدًا لاستخدامه مع EnGen Lba Cas12a؟ ج: يحتوي RNA المرشد (crRNA) لـ EnGen Lba Cas12a على التسلسل التالي: 5´- UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCACUCACUGCUUUCUCCUC -3´. التسلسل الذي تحته خط هو تكرار crRNA، وسيكون نفسه لجميع أدلة EnGen Lba Cas12a. يلي التكرار تسلسل خاص بالهدف (غير مسطر)، والذي يختلف باختلاف الهدف. يمكن أن يتراوح طول التسلسل المستهدف بين 18 و24 نيوكليوتيدًا، ولكن يجب ألا يحتوي أبدًا على تسلسل PAM (TTTV). يجب أن يكون تسلسل PAM موجودًا في الطرف 5' من تسلسل الحمض النووي غير المكمل المستهدف. فيما يلي مثال يوضح شكل تسلسل الحمض النووي لـ crRNA المذكور أعلاه مع وضع خط تحت تسلسل PAM. س: كيف يمكنني تخفيف الإنزيم إلى 1 ميكرومولار للتفاعلات المختبرية؟ ج: إذا كنت تخطط لاستخدام تركيز أعلى من إنزيم EnGen Lba Cas12a (NEB #M0653T) لهضم الحمض النووي في المختبر، فيمكن تخفيف تركيز الإنزيم البالغ 100 ميكرومولار إلى تركيزات أقل في مخفف EnGen Lba Cas12a (B0653A). الإنزيم مستقر ويمكن تخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في هذا المخفف. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: ما هي مكونات مُخفف EnGen Lba Cas12a (NEB #B0653A)؟ أ: يحتوي مخفف إنزيم EnGen Lba Cas12a (NEB #B0653A) على المكونات التالية: 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 20 ملي مولار من أسيتات الصوديوم، 0.5 ملي مولار من EDTA، 0.5 ملي مولار من TCEP-HCl، 50% جلسرين، درجة الحموضة 6 عند 25 درجة مئوية. وهو مطابق تمامًا لمحلول تخزين الإنزيم. يُستخدم مخفف إنزيم EnGen Lba Cas12a (NEB #B0653A) لتخفيف تركيز 100 ميكرومولار من إنزيم EnGen Lba Cas12a إلى تراكيز أقل للتفاعلات المختبرية، عند الحاجة.