نيو إنجلاند بيولابس، M0654T، إنجين® ساو كاس9

تم إيقاف إنتاج الحجم S من هذا المنتج في 31 يوليو 2023. سيظل المنتج M0654T متاحًا للشراء. الفئات ذات الصلة: نوكليازات CRISPR/Cas. المواصفات: شروط التفاعل: 1X NEBuffer™ r3.1، حضانة عند 37 درجة مئوية. NEBuffer™ r3.1: 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 20 ملي مولار Tris-HCl، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار TCEP، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكن تحديد كفاءة تحرير الجينوم بعد عمليات نقل أو حقن EnGen® Sau Cas9 (NEB #M0654)؟ ج: يمكن استخدام إنزيم T7 Endonuclease I (NEB #M0302) أو مجموعة EnGen للكشف عن الطفرات (NEB #E3321S) لتحديد أحداث التحرير الناتجة عن عمليات نقل جينات Sau Cas9 RNP أو الحقن المجهري. كما يمكن استخدام طرق أخرى، بما في ذلك تسلسل الأمبليكون، لتحليل التحرير. س: ما هي إشارة التموضع النووي المدمجة مع EnGen® Sau Cas9؟ ج: يحتوي EnGen Sau Cas9 على إشارات التموضع النووي (NLS) لمستضد T لفيروس SV40 في كل من الطرفين الأميني والكربوكسيلي للبروتين. س: هل يمكن استخدام مجموعة EnGen® لتخليق sgRNA (NEB #E3322S) لتخليق sgRNAs خاصة بـ Sau Cas9؟ ج: لا. مجموعة EnGen لتخليق sgRNA خاصة ببكتيريا S. pyogenes (Spy). س: ما هو تسلسل الحمض النووي الريبوزي الدليلي النموذجي الخاص بإنزيم EnGen® Sau Cas9؟ ج: يبلغ طول الحمض النووي الريبوزي الدليلي النموذجي لإنزيم Sau حوالي 100 نيوكليوتيد، ويحتوي على تسلسل خاص بالهدف يتراوح طوله بين 20 و22 نيوكليوتيدًا (موضح بالحرف N في المثال التالي)، وتسلسل خاص بإنزيم Sau يكون نفسه لجميع الأحماض النووية الريبوزية الدليلية: 5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUU3′. يختلف نطاق الـ 20-22 نيوكليوتيدًا بناءً على الحمض النووي المستهدف، ولكنه لا يتضمن أبدًا تسلسل PAM (NNGRRT، حيث N = أي نيوكليوتيد، وR = A أو G). يقع تسلسل PAM على الحمض النووي المستهدف، مباشرةً في الطرف 3′ من شريط الحمض النووي غير المستهدف في المنطقة المستهدفة. يمكن الاطلاع على مثال أدناه. في هذا المثال، يمثل الشريط السفلي من الحمض النووي المزدوج السلسلة المستهدفة. يوجد تسلسل PAM (NNGRRT، أو ACGGAT في هذا المثال) على السلسلة غير المستهدفة مباشرةً في الطرف 3' من التسلسل المستهدف. س: كيف يمكنني تصنيع sgRNA محدد التسلسل لتجارب باستخدام EnGen® Sau Cas9؟ ج: يمكن تصنيع sgRNAs المستخدمة مع EnGen Sau Cas9 في المختبر باستخدام مجموعة HiScribe® T7 High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2040) أو مجموعة HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050). يمكن أن تكون قوالب الحمض النووي المزدوج إما نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، أو قوالب حمض نووي مزدوج السلسلة اصطناعية، أو بلازميدات خطية. يمكن الاطلاع على توصيات تصميم أكثر تفصيلاً في قسم البروتوكولات. بدلاً من ذلك، يمكن طلب sgRNA اصطناعي من شركة متخصصة في تصنيع الحمض النووي الريبوزي (RNA). س: لماذا ألاحظ هضمًا غير مكتمل باستخدام إنزيم EnGen® Sau Cas9 و sgRNA الخاص بالهدف في المختبر؟ ج: تختلف كفاءة sgRNA باختلاف تسلسلات الهدف المحددة. نوصي باستخدام أداة عبر الإنترنت (تعتمد على عوامل معينة مثل محتوى GC) لاختيار أفضل موقع هدف ضمن الحمض النووي الخاص بك. كما نوصي بتنقية الحمض النووي المزدوج المستهدف والتحقق من سلامة sgRNA على هلام مُشوه. إذا كانت كفاءة sgRNA منخفضة، فإن زيادة النسبة المولية لـ sgRNA:Sau Cas9:الحمض النووي المستهدف إلى 10:10:1 أو أعلى قد تُحسّن من انقسام الحمض النووي. كما نوصي باستخدام محلول NEBuffer™ 3.1 المُرفق للحصول على أفضل النتائج. س: كيف أُخفف الإنزيم إلى 1 ميكرومولار للتفاعلات في المختبر؟ ج: إذا كنت تخطط لتخفيف إنزيم EnGen Sau Cas9 (NEB #M0654T) لهضم الحمض النووي DNA في المختبر، فيمكن تخفيف الإنزيم إلى تركيز 1 ميكرومولار في محلول rNEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X قبل تحضير التفاعل واستخدامه فورًا. أما إذا كنت ستخزن المحلول المخفف بتركيز 1 ميكرومولار عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، فيجب تخفيفه في محلول تخزين الإنزيم: 20 ميكرومولار Tris-HCl، 300 ميكرومولار NaCl، 0.1 ميكرومولار TCEP، و50% جلسرين (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). س: هل يمكنك إخباري المزيد عن استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر.