نيو إنجلاند بيولابس، M0658S، بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7®

تم تصميم بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 للفئات ذات الصلة : تخليق الحمض النووي الريبي، النسخ المختبري (IVT)، محاليل النيوكليوتيدات للحمض النووي الريبي. المواد المطلوبة (غير المرفقة): مثبط RNase، فأري (NEB #M0314) (اختياري)، مزيج محلول النيوكليوتيدات الريبية (NEB #N0466)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لدمج 1 نانومول من ATP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض خلال ساعة واحدة عند 50 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مول من كل من ATP وUTP وGTP وCTP وقالب DNA يحتوي على مُحفِّز بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. يُحضن المزيج عند درجة حرارة 37-56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. درجة حرارة التحضين المثلى هي 50-52 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7® بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من ATP، و0.5 ملي مولار من UTP، و0.5 ملي مولار من GTP، و0.5 ملي مولار من CTP. يُحضن عند 50 درجة مئوية. محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7® بتركيز 1X: 40 ملي مولار من Tris-HCl، 4 ملي مولار من MgCl2، 50 ملي مولار من NaCl، 2 ملي مولار من السبيرميدين، 1 ملي مولار من DTT (الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 50 ملي مولار من Tris-HCl، 100 ملي مولار من NaCl، 1 ملي مولار من EDTA، 1 ملي مولار من DTT، 0.1% (وزن/حجم) من Triton® X-100، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية. شروط فحص الوحدة: محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7® بتركيز 1X، مُضاف إليه 0.5 ملي مولار من كل من ATP. UTP، GTP، CTP، و1 ميكروغرام من الحمض النووي لفيروس T7 في حجم تفاعل 50 ميكرولتر. الأسئلة الشائعة: س: هل يمكنني استخدام محلول تفاعل مختلف للنسخ المختبري باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7؟ ج: لا. تم تصميم محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 خصيصًا للعمل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7. س: هل يتعرف بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 على نفس تسلسل المحفز الذي يتعرف عليه بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 من النوع البري من العاثية؟ ج: نعم. يتعرف كل من بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 وT7 على نفس المحفز: 5′ TAATACGACTCACTATAG 3′، حيث يبدأ النسخ من النيوكليوتيد G. ستكون القاعدة الأولى في النسخة هي G. س: ما هي درجة الحرارة التي يكون عندها بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 نشطًا؟ ج: يكون بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 نشطًا بين 37 درجة مئوية و56 درجة مئوية. عند إجراء تفاعلات النسخ في درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية الموصى بها، يُنصح بتقييد مدة التفاعل إلى 30 دقيقة أو أقل، حيث أن حضانة الحمض النووي الريبوزي (RNA) في درجات حرارة عالية لفترات طويلة بوجود كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) (أحد مكونات محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبوزي Hi-T7) قد يؤدي إلى تحلل الحمض النووي الريبوزي. س: ما هي الأسباب الرئيسية لفشل التفاعل عند استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي Hi-T7؟ ج: نقاء قالب الحمض النووي (DNA) مهم للغاية، ويجب تحضيره باستخدام طرق تنقية مثل عمود الطرد المركزي أو استخلاص الفينول:الكلوروفورم. بالإضافة إلى ذلك، لتجنب تلوث الحمض النووي الريبوزي (RNase)، نوصي بارتداء القفازات واستخدام رؤوس ترشيح وأنابيب خالية من إنزيم RNase. من المهم خلط مكونات التفاعل جيدًا بعد إذابتها، وإعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب المذكور في البروتوكول للحصول على أفضل النتائج. س: ما هي القوالب التي يمكن استخدامها للنسخ في المختبر باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي Hi-T7؟ ج: تشمل أنواع الحمض النووي المزدوج التي يمكن استخدامها كقوالب مع بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 البلازميدات الخطية، ونواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، أو قليل النوكليوتيدات التكميلية المترابطة التي تحتوي على تسلسل محفز T7. س: هل يمكن لبوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 نسخ الحمض النووي الريبي من بلازميد غير مقطوع؟ ج: نعم. يقوم بوليميراز الحمض النووي الريبي Hi-T7 بنسخ الحمض النووي الريبي حول القوالب الدائرية عدة مرات دون أن ينفصل. لنسخ الحمض النووي الريبي بطول محدد، يمكن تحويل البلازميد إلى شكل خطي باستخدام إنزيم تقييد يترك طرفًا غير لاصق أو امتدادًا 5′ أسفل الحمض النووي المطلوب.