نيو إنجلاند بيولابس، M0660S، نيوكلياز P1

الفئات ذات الصلة: الإكسونوكليازات والإندونوكليازات غير النوعية. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحرير 1.0 ميكروغرام من النيوكليوتيدات القابلة للذوبان في الأحماض من الحمض النووي الريبي الكلي لخميرة تورولا في الدقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول تفاعل النيوكلياز P1 بتركيز 1X. شروط التفاعل: محلول تفاعل النيوكلياز P1 بتركيز 1X، يُحضَّن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل النيوكلياز P1 بتركيز 1X، 50 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (الأس الهيدروجيني 5.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 25 ملي مولار من Tris-HCl، 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار من كلوريد الزنك، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.2 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: هل النيوكلياز P1 حساس للملح؟ ج: إنزيم النيوكلياز P1 غير حساس نسبيًا لمحتوى الملح، ومع ذلك يُوصى بأن يظل تركيز الملح النهائي في التفاعل ≤ 250 ملي مولار. س: هل يمكن تعطيل إنزيم النيوكلياز P1؟ ج: نعم، يمكن تعطيل إنزيم النيوكلياز P1 بإضافة EDTA (بتركيز نهائي 5 ملي مولار) أو بالتسخين لمدة 10 دقائق عند 75 درجة مئوية. س: هل يحتاج إنزيم النيوكلياز P1 إلى كلوريد الزنك (ZnCl2)؟ ج: نعم، يحتاج إنزيم النيوكلياز P1 إلى كلوريد الزنك، وبالتالي يمكن تثبيطه/تعطيله بإضافة EDTA. عند استخدام إنزيم النيوكلياز P1، يكون تركيز كلوريد الزنك في محلول التخزين كافيًا بحيث لا يلزم إضافة المزيد منه إلى التفاعل. س: ما هي التطبيقات الأنسب لإنزيم النيوكلياز P1؟ ج: يمكن استخدام إنزيم النيوكلياز P1 لإزالة ذيول السلاسل المفردة من جزيئات الحمض النووي DNA لإنتاج جزيئات ذات نهايات غير لاصقة، وفصل حلقات الدبوس، وتحليل التركيب القاعدي للحمض النووي DNA أو RNA، وإزالة الأحماض النووية أثناء تنقية البروتين. س: ما هي الركائز التي يهضمها إنزيم النيوكلياز P1؟ ج: تكون خصوصية الركيزة لإنزيم النيوكلياز P1 كما يلي: 3′AMP > RNA > ssDNA >> dsDNA. س: ما كمية ssDNA أو RNA التي يمكن لإنزيم النيوكلياز P1 هضمها؟ ج: يمكن لإنزيم النيوكلياز P1 (وحدة واحدة) تحرير 1 ميكروغرام من النيوكليوتيدات من ssDNA أو RNA في الدقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. س: ما هو نشاط إنزيم النيوكلياز P1 في محاليل منظمة أخرى؟ ج: إنزيم النيوكلياز P1 نشط ضمن نطاق واسع من قيم الأس الهيدروجيني (الأمثل بين 4.0 و7.0). بالإضافة إلى ذلك، ولأن إنزيم النيوكلياز P1 يتطلب كلوريد الزنك (ZnCl2)، يجب أن يكون محلول التفاعل خاليًا من كميات كبيرة (< 5 ملي مولار) من عوامل الاستخلاب (مثل EDTA). عند استخدام إنزيم النيوكلياز P1، يكون تركيز كلوريد الزنك في محلول التخزين (5 ملي مولار) كافيًا بحيث لا يلزم إضافة المزيد منه إلى التفاعل. NEBuffer 1.1 2.1 3.1 CutSmart® % النشاط 100 50 25 50 النشاط في محاليل أخرى: المحلول % النشاط محلول مزيج هضم النيوكليوزيد 100% محلول Taq القياسي 50% محلول Thermopol 25% محلول Q5 50% محلول DNase I 75% محلول Endo III 75% محلول Exo I 25% محلول Exo VII 0% محلول Lambda Exo 0% محلول النيوكلياز الميكروكوكي 25% محلول نيوكلياز الفاصوليا المونج 50% س: كيف يرتبط تعريف الوحدة الجديد بتعريف الوحدة التاريخي للنيوكلياز P1؟ أ: التعريف التاريخي لوحدة نشاط فوسفودايستراز 3′-5′ في إنزيم نوكلياز P1 هو كما يلي: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحرير 1.0 ميكرومول من النيوكليوتيدات القابلة للذوبان في الأحماض من الحمض النووي الريبي الكلي لخميرة تورولا في الدقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في محلول منظم نوكلياز P1 بتركيز 1X. تم تحديث هذا التعريف ليكون قابلاً للمقارنة مباشرةً مع تعريف وحدة فوسفودايستراز 3′-5′ في إنزيم نوكلياز S1، بحيث أصبح تعريف وحدة نشاط فوسفودايستراز 3′-5′ في إنزيم نوكلياز P1 من شركة NEB كما يلي: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحرير 1.0 ميكروغرام من النيوكليوتيدات القابلة للذوبان في الأحماض من الحمض النووي الريبي الكلي لخميرة تورولا في الدقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في محلول منظم نوكلياز P1 بتركيز 1X. بفضل هذا التعريف المُحدَّث للوحدة، يُعدّ إنزيم نيوكلياز P1 من شركة NEB بديلاً سهلاً لإنزيم نيوكلياز S1. سؤال: هل يُحلِّل إنزيم نيوكلياز P1 الحمض النووي المزدوج (dsDNA)؟ جواب: على الرغم من كونه إنزيم نيوكلياز مُخصَّصًا للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA وRNA)، إلا أن إنزيم نيوكلياز P1 يُظهر بعض النشاط تجاه الحمض النووي المزدوج في محلول تفاعل نيوكلياز P1. في حال الرغبة في تحليل الأحماض النووية أحادية السلسلة (ssDNA أو RNA) بشكل تفضيلي في وجود الحمض النووي المزدوج (dsDNA)، نوصي باستخدام إنزيم نيوكلياز P1 في محلول NEBuffer 1.1 بتركيز 1X للحد من نشاطه على الحمض النووي المزدوج مع الحفاظ على نشاطه كإنزيم نيوكلياز أحادي السلسلة.