مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0665S، Tth Argonaute (TtAgo)

إنزيم الأرجونوت (TtAgo) هو إنزيم نوكلياز داخلي قابل للبرمجة، يتطلب دليلاً قصيراً من الحمض النووي أحادي السلسلة مُفسفر عند الطرف 5' لتوجيه نشاطه إلى تسلسل مُحدد مُطابق على الركيزة. يُحدث TtAgo قطعاً واحداً في العمود الفقري الفوسفودايستري لتسلسل الركيزة المُكمل. الفئات ذات الصلة: مواصفات الأرجونوت، توافق المُخفف، المُخفف B، محلول التخزين : 10 ملي مولار Tris-HCl، 300 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية، التعطيل الحراري : لا، الأسئلة الشائعة: س: هل يُمكنني تحضير أدلة وظيفية لـ TtAgo من قليل النوكليوتيدات الاصطناعية غير المُعدلة؟ ج: نعم. يمكنك طلب أوليغونوكليوتيدات غير معدلة وفسفرة الأدلة باستخدام إنزيم NEB T4 Polynucleotide Kinase وبروتوكول إنشاء أدلة 5′-Phosphorylated من أوليغونوكليوتيدات غير معدلة لاستخدامها مع TtAgo. هذه الطريقة مناسبة للفحص عالي الإنتاجية للأدلة المطلوبة في لوحة PCR ذات 96 بئرًا. س: يبدو أن بعض الأدلة لا تعمل بكفاءة مع TtAgo. ما الحل؟ ج: على الرغم من ملاحظتنا أن بعض تسلسلات الأدلة تُستغل بشكل أمثل بواسطة TtAgo من غيرها (يرجى الرجوع إلى إرشادات تحسين تفاعلات Tth Argonaute (TtAgo) للحصول على معلومات وتوصيات مفصلة لتصميم أدلة ناجحة)، إلا أن هناك مصدرًا آخر محتملاً للمشاكل قد ينشأ عن عدم اكتمال فسفرة 5′ للدليل. لاحظنا أنه عند طلب هذا التعديل من موردي الأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية، قد يختلف مستوى الفسفرة والنشاط المقابل اختلافًا كبيرًا. لحل هذه المشكلة، نقترح أحد الخيارين التاليين: 1) طلب أدلة غير معدلة وفسفرة هذه الأدلة باستخدام إنزيم NEB T4 Polynucleotide Kinase وبروتوكول إنشاء أدلة 5′-Phosphorylated من قليل النوكليوتيدات غير المعدلة لاستخدامها مع TtAgo، أو 2) إذا تم طلب أدلة مفسفرة مسبقًا، فما عليك سوى اتباع نفس البروتوكول المذكور في الخيار 1 مع استخدام إنزيم NEB T4 Polynucleotide Kinase كخطوة تلميع للفسفرة. بشكل عام، تعمل الأدلة المطلوبة مع تعديلات الفسفرة بشكل جيد، ولكن تجدر الإشارة إلى أننا لاحظنا أن أداء قليل النوكليوتيدات الدليلية المفسفرة باستخدام إنزيم NEB T4 Polynucleotide Kinase يضاهي أو يتفوق على أداء تلك المطلوبة مع تعديل الفسفرة. س: كيف يمكنني تقليل نشاط الإندونوكلياز غير المحدد مع TtAgo؟ أ: يمكن ملاحظة نشاط غير نوعي مع الركائز ثنائية السلاسل، حيث يُظهر إنزيم TtAgo نشاطًا تحليليًا في شكله الخالي من الدليل (apo-form)، يُعرف باسم "التقطيع" [Swarts, et al. 2017]. يُعتقد أن نشاط الأرجونوت هذا يُساهم في تكوين أدلة جديدة للدفاع الخلوي، ولكنه قد يُسبب مشاكل في المختبر. لاحظنا أن بعض تسلسلات الدليل، على الرغم من فعاليتها في توجيه نشاط إنزيم TtAgo الداخلي، قد لا يتم تحميلها بكفاءة في الأرجونوت. وبالتالي، قد يُهيمن نشاط "التقطيع" على النشاط الموجه. في هذه الحالات، نوصي بتحميل الدليل مسبقًا بإنزيم TtAgo قبل محاولة التفاعل. امزج الدليل والأرجونوت في محلول تفاعل NEB ThermoPol® بتركيز 1X، ثم حضّن المزيج عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. نوصي باستخدام الدليل بزيادة مولية من 3 إلى 5 أضعاف تركيز TtAgo لتقليل النشاط غير النوعي. لاحظنا أيضًا أن خفض درجة حرارة التفاعل، ومعايرة كمية المغنيسيوم فيه (بدرجة أقل)، قد يؤثر على كمية النشاط غير النوعي المُلاحَظ. س: هل يُمكنني تخزين TtAgo مع دليل مُحمَّل؟ ج: لا نوصي بتخزين TtAgo مع دليل مُحمَّل. فبينما يكون مُركَّب البروتين النووي "المُحمَّل" مستقرًا لمدة يوم إلى يومين عند تخزينه بشكل صحيح في درجة حرارة تتراوح بين -20 و4 درجات مئوية، فإن وجود دليل الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) يُضر بالاستقرار طويل الأمد ونشاط الإندونوكلياز المُوجَّه الموثوق. امزج TtAgo ودليل الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) قبل الاستخدام المُراد بفترة وجيزة، وبنسبة تتناسب مع حجم التجربة التي ترغب في إجرائها. خزِّن المُركَّب على الجليد عند عدم استخدامه فورًا. س: هل TtAgo نشط في محاليل NEB الأخرى؟ ج: يُظهر TtAgo أعلى مستوى من النشاط في محلول NEB ThermoPol® Reaction Buffer، ومع ذلك، يُلاحَظ نشاط ملحوظ في العديد من محاليل NEB القياسية الأخرى أيضًا. قد تُحقق نتائج مناسبة حتى في محاليل منظمة غير مثالية مع فترات تفاعل ممتدة. س: هل إنزيم TtAgo نشط عند درجات حرارة أخرى؟ ج: إنزيم TtAgo هو إنزيم محب للحرارة مُستخلص من بكتيريا Thermus thermophilus. على الرغم من أنه نشط في نطاق واسع من درجات الحرارة (من 65 إلى 85 درجة مئوية تقريبًا) (انظر الشكل أدناه)، إلا أننا نوصي بإجراء التفاعلات الروتينية في نطاق درجة حرارة من 75 إلى 80 درجة مئوية. س: ما هي كمية أيونات المغنيسيوم (Mg2+) التي يجب إضافتها إلى التفاعل النموذجي؟ ج: يحتوي محلول التفاعل NEB ThermoPol® على 2 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم (Mg2SO4)، وهو مناسب لمعظم التفاعلات التي تُجرى باستخدام إنزيم TtAgo. يمكن أن تُحسّن الكميات الأكبر من أيونات المغنيسيوم (Mg2+) أداء إنزيم TtAgo على بعض الركائز، ولكنها قد تؤدي أيضًا إلى نشاط غير طبيعي خارج الهدف. يُلاحظ اتجاه مشابه لأداء عام أفضل قليلاً مصحوبًا بنشاط غير مستهدف عند استخدام TtAgo مع أيونات المنغنيز (Mn2+) كما هو الحال مع أيونات المغنيسيوم (Mg2+)، إلا أن نطاق تركيزات المنغنيز (Mn2+) أقل (من 0.1 إلى 2 ملي مولار) مقارنةً بنطاق تركيزات المغنيسيوم (Mg2+) (من 0.5 إلى 5 ملي مولار). لمزيد من المعلومات، يُرجى الرجوع إلى إرشادات تحسين تفاعلات Tth Argonaute (TtAgo). سؤال: ماذا لو أردت استخدام TtAgo مع أيونات المنغنيز (Mn2+) بدلاً من أيونات المغنيسيوم (Mg2+) كما هو مُقدم في محلول التفاعل ThermoPol®؟ جواب: يمكن لـ TtAgo استخدام أيونات المغنيسيوم (Mg2+) أو المنغنيز (Mn2+) في موقعه النشط. ظروف التفاعل النموذجية في محلول التفاعل NEB ThermoPol® المُقدم تسمح بإضافة أيونات المنغنيز (Mn2+) إلى التفاعل بوجود 2 ملي مولار من أيونات المغنيسيوم (Mg2+) مع تأثير مشابه لتأثير استخدام أيونات المنغنيز (Mn2+) وحدها. مع ذلك، إذا لم تكن هناك حاجة لأيونات المغنيسيوم (Mg2+) في التفاعل، يُمكن تحضير محلول منظم مُخصص. نوصي باستخدام محلول منظم Tris-HCl بتركيز 20 ملي مولار ودرجة حموضة 8.8 مع تركيز منخفض من الملح (حوالي 10 ملي مولار من كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم) وإضافة أيونات المنغنيز (Mn2+) إلى التركيز المطلوب (عادةً ما يتراوح بين 0.1 و2 ملي مولار). يُلاحظ اتجاه مشابه لأداء عام أفضل قليلاً مصحوبًا بنشاط غير مُستهدف عند استخدام TtAgo مع أيونات المنغنيز كما هو الحال مع أيونات المغنيسيوم، إلا أن نطاق تركيزات العمل لأيونات المنغنيز أقل (من 0.1 إلى 2 ملي مولار) مقارنةً بأيونات المغنيسيوم (من 0.5 إلى 5 ملي مولار). لمزيد من المعلومات، يُرجى الرجوع إلى إرشادات تحسين تفاعلات Tth Argonaute (TtAgo).