نيو إنجلاند بيولابس، M0668T، EnGen® Seq1 Cas9

الفئات ذات الصلة: نوكليازات CRISPR/Cas، المواصفات، شروط التفاعل: 1X NEBuffer™ r3.1، حضانة عند 37 درجة مئوية، 1X NEBuffer™ r3.1، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) ، محلول التخزين: 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية ، التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، الأسئلة الشائعة : س: أين تقع إشارة التوطين النووي على EnGen® Seq1 Cas9؟ ج: يحتوي EnGen Seq1 Cas9 على إشارتي توطين نووي تقعان على الطرفين الأميني والكربوكسيلي للبروتين. س: ما هي إشارة التموضع النووي المدمجة مع EnGen® Seq1 Cas9؟ ج: يحتوي EnGen Seq1 Cas9 على إشارة التموضع النووي لمستضد T لفيروس SV40 على الطرفين الأميني والكربوكسيلي للبروتين. س: ما الفرق بين EnGen® Seq1 Cas9 وEnGen Sau Cas9 (NEB #M0654) وEnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)؟ ج: EnGen Seq1 Cas9 وEnGen Sau Cas9 وEnGen Spy Cas9 NLS هي نظائر Cas9 من Streptococcus equinus وStaphylococcus aureus وStreptococcus pyogenes على التوالي. وهي تتعرف على الأنماط المجاورة للبروتوسبيسر (PAMs) لـ NAGA وNNGRRT وNGG على التوالي. س: لماذا ألاحظ عدم اكتمال عملية الهضم/التحرير مع EnGen® Seq1 Cas9؟ ج: قد يعود عدم اكتمال الهضم إلى العوامل التالية: نسبة غير مثالية من نوكلياز Cas9 إلى الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد وموقع الحمض النووي المستهدف - للحصول على هضم كامل، نوصي بنسبة مولية 10:10:1 أو أعلى من نوكلياز Cas9: الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد: موقع الحمض النووي المستهدف. تسلسل غير مثالي للحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد - تحقق من تسلسل وتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد. جودة رديئة للحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد - تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي. محلول تفاعل غير مثالي - يرجى استخدام NEBuffer™ r3.1 المرفق مع الإنزيم. س: لماذا تختلف كفاءة الهضم/التحرير بين نوعين مختلفين من الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد؟ ج: قد تتأثر كفاءة الهضم بتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد. تحقق من تسلسل وتصميم قالب نسخ الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد. قد تتأثر أيضًا بجودة الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد. تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي. بالإضافة إلى ذلك، فإن بعض مواقع الحمض النووي أكثر ملاءمة للتحرير من غيرها. يرجى اختبار مواقع مستهدفة متعددة/تسلسلات الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد المناسبة للطفرة المطلوبة. س: هل توفر شركة NEB بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد؟ ج: لا نوزع بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد، ولكننا نوصي بزيارة موقع Addgene إذا كنت ترغب في الحصول على بلازميدات الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد. يمكن استخدام قوالب الحمض النووي التي تحتوي على محفز T7 وتشفّر الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد مع مجموعة HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050). بالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من المصادر التجارية المتاحة للحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد الاصطناعي. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل يمكن الكشف عن الطفرات الناتجة عن EnGen Seq1 Cas9 باستخدام إنزيم T7 Endonuclease I (NEB #M0302) أو مجموعة EnGen للكشف عن الطفرات (NEB #E3321S)؟ ج: نعم، يمكن استخدام كلا المنتجين للكشف عن عمليات تعديل الجينوم الناتجة عن EnGen Seq1 Cas9. س: هل يمكن توليد الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) لاستخدامه مع إنزيم EnGen Seq1 Cas9 باستخدام مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (NEB #E3322)؟ ج: لا، لا يمكن استخدام مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes، لتوليد الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) لإنزيم EnGen Seq1 Cas9. إن الحمض النووي السقالي الموجود في مزيج تفاعل الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA Reaction Mix) بتركيز 2X، والذي يحتوي على تسلسل tracrRNA، متوافق فقط مع إنزيم S. pyogenes Cas9. س: كيف أصمم حمضًا نوويًا ريبوزيًا مرشدًا واحدًا لاستخدامه مع إنزيم EnGen Seq1 Cas9؟ ج: يحتوي الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد (sgRNA) المستخدم مع إنزيم EnGen Seq1 Cas9 على التسلسل التالي: 5'- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGGAAACAACACAGCGAGUUAAAAUAAGGCUUUGUCCGUACACAACUUGUAAAAGUGGCACCCGAUUCGGGUGCAUUUUUU -3'. تسلسل الفاصل المكون من 20 نيوكليوتيدًا والمُسطَّر خاص بمنطقة الحمض النووي المستهدفة المطلوبة، والتي تقع مباشرةً قبل النمط المجاور للبروتوسبيسر 5'-NAGA-3'. لا يحتوي تسلسل الفاصل على تسلسل PAM نفسه. الجزء غير المُسطَّر من الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد (sgRNA) هو الهيكل الخاص بتكوين معقد البروتين النووي الريبوزي مع إنزيم EnGen Seq1 Cas9. س: كيف يمكنني تخفيف الإنزيم إلى 1 ميكرومولار للتفاعلات المختبرية؟ ج: إذا كنت تخطط لاستخدام الإنزيم بتركيز أعلى لهضم الحمض النووي في المختبر، فيمكن تخفيف الإنزيم إلى 1 ميكرومول في محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X واستخدامه فورًا. يجب عدم تجميد محلول التخفيف بتركيز 1 ميكرومول في محلول NEBuffer r3.1 بتركيز 1X. إذا كنت ستخزن محلول التخفيف بتركيز 1 ميكرومول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، فيجب تخفيفه باستخدام المخفف B (مع الألبومين المؤتلف) (NEB #B8533S): 300 ميكرومول من كلوريد الصوديوم، 10 ميكرومول من Tris-HCl، 0.1 ميكرومول من EDTA، 1 ميكرومول من DTT، 500 ميكروغرام/مل من الألبومين المؤتلف، و50% جلسرين (الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية) قبل بدء التفاعل. س: لماذا ألاحظ عدم اكتمال عملية الهضم/التحرير باستخدام EnGen® Spy Cas9 HF1؟ ج: قد يعود عدم اكتمال الهضم إلى العوامل التالية: نسبة غير صحيحة من نوكلياز Cas9 إلى الحمض النووي الريبوزي الدليل، وموقع الهدف - للحصول على هضم كامل، نوصي بنسبة مولية 10:10:1 أو أعلى من نوكلياز Cas9: الحمض النووي الريبوزي الدليل: موقع الهدف. تسلسل غير مثالي للحمض النووي الريبوزي الدليل - تحقق من تسلسل وتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليل. جودة رديئة للحمض النووي الريبوزي الدليل - تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليل عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي. محلول منظم غير مثالي - يرجى استخدام محلول NEBuffer™ r3.1 المرفق مع الإنزيم. س: هل توفر NEB بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الدليل؟ ج: لا نوزع بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الدليل الفرعي، ولكننا نوصي بزيارة Addgene إذا كنت ترغب في الحصول على بلازميدات الحمض النووي الريبوزي الدليل الفرعي. يمكن استخدام قوالب الحمض النووي قليلة النوكليوتيدات التي تحتوي على محفز T7 وتشفر الحمض النووي الريبوزي الدليل الفرعي مع مجموعة HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050). نوصي باستخدام مجموعة EnGen® sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (NEB #E3322S)، التي تستخدم أوليغومرات DNA محددة الهدف مصممة من قبل المستخدم، وتوفر طريقة سريعة لنسخ كميات كبيرة من sgRNA في تفاعل واحد مدته 30 دقيقة. س: ما الفرق بين EnGen® Spy Cas9 HF1 وEnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)؟ ج: EnGen Spy Cas9 HF1 هو نسخة عالية الدقة، ذات استبدال رباعي (N497A/R661A/Q695A/Q926A)، من EnGen Spy Cas9 NLS من Streptococcus pyogenes، مع تقليل انقسام DNA غير المحدد. س: أين تقع إشارة التموضع النووي على EnGen® Spy Cas9 HF1؟ ج: يحتوي بروتين EnGen Spy Cas9 HF1 على إشارتين لتحديد الموقع النووي، تقعان على طرفي البروتين الأميني والكربوكسيلي. س: ما هي إشارة تحديد الموقع النووي المدمجة مع بروتين EnGen® Spy Cas9 HF1؟ ج: يحتوي بروتين EnGen Spy Cas9 HF1 على إشارة تحديد الموقع النووي (NLS) لمستضد T الخاص بفيروس SV40، على طرفي البروتين الأميني والكربوكسيلي.