نيو إنجلاند بيولابس، M0669T، إنجين® سبري كاس9

الفئات ذات الصلة: نوكليازات CRISPR/Cas، المواصفات، شروط التفاعل: 1X NEBuffer™ r3.1، حضانة عند 37 درجة مئوية، 1X NEBuffer™ r3.1، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 50 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) ، محلول التخزين: 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية ، التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، الأسئلة الشائعة: س: لماذا يُسمى EnGen SpRY Cas9؟ ج: اسم SpRY مشتق من S. pyogenes وتفضيلها لـ 5´-NRN-3´ على 5´-NYN-3´ PAMs في الجسم الحي (حيث يرمز R إلى البيورينات (A أو G) وY إلى البيريميدينات (C أو T)). مع ذلك، لا يُظهر SpRY Cas9 أي تفضيل يُذكر لـ PAMs في المختبر. س: ما الفرق بين EnGen SpRY Cas9 وEnGen Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) وEnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)؟ ج: يُشفّر EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646) تسلسل الأحماض الأمينية لبروتين Cas9 الأصلي، بينما يُشفّر EnGen Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) أربع طفرات نقطية في تسلسل الأحماض الأمينية لبروتين Cas9 (N497A، R661A، Q695A، Q926A) لتقليل الانقسام غير المستهدف. أما EnGen SpRY Cas9 فيُشفّر 11 طفرة نقطية في تسلسل الأحماض الأمينية لبروتين Cas9 (A61R، L1111R، D1135L، S1136W، G1218K، E1219Q، N1317R، A1322R، R1333P، R1335Q، T1337R) لتخفيف متطلبات PAM. س: كيف يُمكنني تصميم دليل RNA واحد لاستخدامه مع EnGen SpRY Cas9؟ أ: يستخدم إنزيم EnGen SpRY Cas9 نفس هيكل الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد المستخدم في إنزيمات Cas9 الأخرى الخاصة ببكتيريا S. pyogenes: 5´-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3´. تمثل النيوكليوتيدات N تسلسل 20 نيوكليوتيدًا خاصًا بالهدف المحدد من الحمض النووي. يمكن شراء الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد الاصطناعي من شركة متخصصة في تصنيع قليل النيوكليوتيدات. بدلاً من ذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى إنتاجية أعلى، يمكن شراء مجموعة NEB EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (NEB #E3322). يوضح الشكل التالي كيفية تصميم دليل (أو أدلة) لموقع قطع محدد في الحمض النووي: لكل كسر مطلوب في سلسلتي الحمض النووي المستهدف، يتوفر حمضان نوويان ريبوزيان دليليان مفردان (يستهدفان أيًا من سلسلتي الحمض النووي) عند استخدام إنزيم EnGen SpRY Cas9. س: كيف أخفف إنزيم EnGen® SpRY Cas9 إلى تركيز 1 ميكرومولار للتفاعلات المختبرية؟ ج: إذا لزم التخفيف، خفف محلول الإنزيم المرفق بتركيز 20 ميكرومولار بنسبة 1:20 باستخدام محلول NEBuffer™ r3.1 بتركيز 1X قبل بدء التفاعلات المختبرية. س: لماذا ألاحظ عدم اكتمال عملية الهضم/التحرير باستخدام EnGen® SpRY Cas9؟ ج: قد يعود عدم اكتمال الهضم إلى العوامل التالية: نسبة غير مثالية من نوكلياز Cas9 إلى الحمض النووي الريبوزي الدليل وموقع الهدف. للهضم الكامل، نوصي بنسبة مولية 10:10:1 أو أعلى من نوكلياز Cas9: الحمض النووي الريبوزي الدليل: هدف الحمض النووي. قد تتطلب عملية استطالة البلازميد نسبًا أعلى من النيوكلياز/الحمض النووي الريبوزي الدليل. تسلسل غير مثالي للحمض النووي الريبوزي الدليل. تحقق من تسلسل وتصميم الحمض النووي الريبوزي الدليل. جودة رديئة للحمض النووي الريبوزي الدليل. تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الدليل باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي. محلول منظم غير مثالي. يرجى استخدام محلول NEBuffer™ r3.1 المرفق مع الإنزيم. س: هل من الضروري تنظيف ناتج التفاعل قبل استخدام نواتج الهضم مع NEBuilder؟ ج: ليس من الضروري تنظيف ناتج هضم SpRY قبل الاستنساخ باستخدام NEBuilder، ولكن قد يُحسّن ذلك النتائج. س: أين تقع إشارة التموضع النووي على EnGen SpRY Cas9؟ ج: يحتوي EnGen SpRY Cas9 على إشارة تموضع نووي تقع على الطرف الكربوكسيلي للبروتين. س: ما هي إشارة التموضع النووي المدمجة مع EnGen SpRY Cas9؟ ج: يحتوي EnGen SpRY Cas9 على إشارة التموضع النووي لمستضد T لفيروس SV40 على الطرف الكربوكسيلي للبروتين. س: هل توفر NEB بلازميدات لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الموجه (sgRNA)؟ ج: لا نوزع بلازميدات لاستنساخ sgRNA، ولكننا نوصي باستخدام Addgene إذا كنت ترغب في الحصول على بلازميدات sgRNA. يمكن استخدام قوالب الحمض النووي التي تحتوي على مُحفِّز T7 وتُشفِّر الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) مع مجموعة HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050). نوصي باستخدام مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (NEB #E3322S)، التي تستخدم قليل النوكليوتيدات DNA المُصمَّمة خصيصًا للهدف من قِبَل المستخدم، وتُوفِّر طريقة سريعة لنسخ كميات كبيرة من الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) في تفاعل واحد مدته 30 دقيقة. س: هل يُمكنكم إخباري المزيد عن التحوّل من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ أ: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ويمكننا تقديم هذا التحسين بنفس السعر.