مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، M0678S، إنزيم نوكلياز داخلي غير متطابق I

الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية الخاصة بالبنية. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لقطع 50% من 0.2 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 60 قاعدة موسوم بالفلورة يحتوي على عدم تطابق T:T واحد في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في محلول NEBuffer r2.1 بتركيز 1X. شروط التفاعل: محلول NEBuffer™ r2.1 بتركيز 1X، يُحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. NEBuffer™ r2.1: 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 500 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: ما هو نشاط إنزيم Mismatch Endonuclease I في محاليل أخرى؟ ج: يُبين الجدول أدناه النشاط النسبي لإنزيم عدم تطابق القواعد I في المحاليل المنظمة التالية: المحلول المنظم % النشاط 1 NEBuffer r1.1 50% NEBuffer r2.1 100% NEBuffer r3.1 25% rCutSmart™ Buffer 75% Q5® Reaction Buffer2 0% ThermoPol Reaction Buffer2 25% Standard Taq Reaction Buffer2 75% Phusion HF Buffer2 100% 1 نسبة النشاط مُدرجة مقارنةً بالمحلول المنظم الأمثل، NEBuffer r2.1. 2 مُضاف إليه 10 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم. س: هل يمكن تعطيل إنزيم عدم تطابق القواعد I؟ ج: نعم، يمكن تعطيل إنزيم عدم تطابق القواعد I بإضافة EDTA (بتركيز نهائي 10 ملي مولار) أو بالتسخين لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية. س: ما هو نشاط إنزيم Mismatch Endonuclease I عند درجات حرارة أخرى غير 37 درجة مئوية؟ ج: 30 درجة مئوية = 75%، 37 درجة مئوية = 100%، 42 درجة مئوية = 100%، 50 درجة مئوية = 75%. س: هل يتطلب إنزيم Mismatch Endonuclease I وجود كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)؟ ج: نعم، يتطلب إنزيم Mismatch Endonuclease I وجود كلوريد المغنيسيوم (MgCl2). يتوفر كلوريد المغنيسيوم في محلول NEBuffer r2.1، لذا إذا تم استخدام إنزيم Mismatch Endonuclease I مع محلول NEBuffer r2.1 المرفق، فلا حاجة لإضافة أي مغنيسيوم إضافي إلى التفاعل. أما إذا تم استخدام إنزيم Mismatch Endonuclease I في محلول منظم آخر غير NEBuffer r2.1، فقد يلزم إضافة المغنيسيوم لضمان الأداء الأمثل للإنزيم. س: هل يمكن لإنزيم Mismatch Endonuclease I العمل في وجود كاتيونات ثنائية التكافؤ أخرى؟ ج: تعمل الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى، مثل Mn2+ وCo2+ وNi2+ وZn2+، على إزاحة Mg2+ اللازم للنشاط وتثبيط نشاط إنزيم Mismatch Endonuclease I. لا يتأثر نشاط هذا الإنزيم بوجود أيونات Ca2+. س: هل إنزيم Mismatch Endonuclease I حساس للملح؟ ج: لا، إنزيم Mismatch Endonuclease I غير حساس نسبيًا للملح. مع ذلك، فإن تركيزات الملح التي تزيد عن 250 ملي مولار قد تقلل من نشاطه. من المهم ملاحظة أن إنزيم Mismatch Endonuclease I يُخزن في محلول مخفف عالي الملوحة (500 ملي مولار)، لذا ينتقل بعض الملح إلى التفاعل من محلول التخزين، ويجب أخذه في الاعتبار عند تحديد تركيز الملح النهائي لأي تفاعل. س: ما هي الركائز غير المتطابقة التي يقوم إنزيم Mismatch Endonuclease I بقطعها؟ ج: يفضل إنزيم Mismatch Endonuclease I قطع عدم تطابق الحمض النووي T:T و G:G و T:G، ولكنه يقطع أيضًا بسهولة عدم تطابق الحمض النووي T:I و G:I و G:U. بالإضافة إلى ذلك، يقوم إنزيم Mismatch Endonuclease I بقطع السلسلة المحتوية على الثايمين في حالة عدم تطابق الحمض النووي T:C، ويقطع عدم تطابق الحمض النووي T:G و T:U (DNA:RNA)، وإن كان ذلك بدرجة أقل من عدم تطابق الحمض النووي DNA:DNA. س: هل يقطع إنزيم Mismatch Endonuclease I عدم التطابق المتتالي؟ ج: نعم، يقطع إنزيم Mismatch Endonuclease I الركيزة التي تحتوي على عدم تطابق متتالي T:T أو G:G أو T:G. ومع ذلك، لا يستطيع إنزيم Mismatch Endonuclease I قطع ركيزة الحمض النووي المنتفخة التي تحتوي على أكثر من عدم تطابقين متتاليين. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان الحمض النووي الخاص بك يحتوي على عدة عدم تطابق متسلسلة، فإن إنزيم Mismatch Endonuclease I سيقطع بشكل تفضيلي عند عدم تطابق T:T على عدم تطابق G:G أو T:G. س: هل يقطع إنزيم Mismatch Endonuclease I عدم التطابق في الحمض النووي الهجين DNA/RNA؟ ج: نعم، سيقطع إنزيم Mismatch Endonuclease I عدم تطابق T:G وT:U (DNA:RNA). س: ما هي حالات عدم التطابق التي لا يقطعها إنزيم Mismatch Endonuclease I؟ ج: لن يقطع إنزيم Mismatch Endonuclease I حالات عدم تطابق A:A، A:C، A:G، C:C في الحمض النووي، أو الحمض النووي المزدوج القواعد وفقًا لقواعد واتسون-كريك. س: ما عدد البيكومولات من الحمض النووي غير المتطابق التي يمكن لإنزيم Mismatch Endonuclease I قطعها؟ ج: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لقطع 50% من 0.2 بيكومول من عدم تطابق T:T واحد خلال 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في محلول NEBuffer r2.1 بتركيز 1X. يحتوي 1 ميكرولتر من إنزيم Mismatch Endonuclease I على 80 وحدة، وبالتالي، فإن 1 ميكرولتر من هذا الإنزيم قادر على قطع 8 بيكومول من الحمض النووي غير المتطابق بشكل كامل. س: ما الفرق بين إنزيم Mismatch Endonuclease I وإنزيم T7 Endonuclease I؟ ج: على الرغم من أن إنزيم T7 Endonuclease I فعال على الحمض النووي غير المتطابق، إلا أنه ليس الإنزيم الأمثل لقطع جميع حالات عدم تطابق زوج القاعدة الواحد في الحمض النووي الهجين. مع ذلك، إذا كان من المعروف أن عدم التطابق يحتوي على C، فيمكنك استخدام هذا الإنزيم في اختبارك. لا يتعرف إنزيم Mismatch Endonuclease I على جميع حالات عدم التطابق في الحمض النووي ولا يقطعها. إنزيم Mismatch Endonuclease I مثالي لقطع عدم تطابق القواعد T:T و G:G و T:G في الحمض النووي DNA، ولكنه يقطع أيضًا عدم تطابق القواعد T:I و G:I و G:U، وعدم تطابق القواعد T:G و T:U في الحمض النووي DNA مع الحمض النووي الريبي RNA، كما أنه يُحدث قطعًا في سلسلة الحمض النووي DNA التي تحتوي على الثايمين في حالات عدم تطابق القواعد T:C. س: ما الفرق بين إنزيم Mismatch Endonuclease I (NEB #M0678) وإنزيم Authenticase (NEB #M0689)؟ ج: إنزيم Mismatch Endonuclease I يقطع فقط حالات عدم تطابق القواعد التالية في الحمض النووي DNA: G/G و G/T و T/T. أما إنزيم Authenticase فيقطع جميع حالات عدم تطابق القواعد المفردة (باستثناء G/A) وجميع حالات عدم تطابق القواعد المكونة من زوجين أو أكثر، بالإضافة إلى عمليات الإدخال والحذف (indels).