نيو إنجلاند بيولابس، M0681L، إندورو® النسخ العكسي

الفئات ذات الصلة: تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)، النسخ العكسي (تخليق الحمض النووي التكميلي). المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة ): مزيج محلول ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) (NEB #N0447)، مثبط إنزيم RNase، فأري (NEB #M0314)، ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500). الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين إنزيم النسخ العكسي Induro (NEB #M0681) وإنزيم النسخ العكسي ProtoScript II (NEB #M0368)؟ ج: يوجد نوعان رئيسيان من إنزيمات النسخ العكسي (RT): إنزيمات النسخ العكسي المشفرة بواسطة الفيروسات القهقرية وإنزيمات النسخ العكسي المشفرة بواسطة الإنترونات. يشترك كلا النوعين في بعض المجالات المحفوظة ويقومان بتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA). تُشتق أكثر إنزيمات النسخ العكسي شيوعًا ودراسةً من الفيروسات القهقرية، مثل فيروس لوكيميا الفئران مولوني (M-MuLV، MMLV)، مثل إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II. في المقابل، يُعد إنزيم النسخ العكسي Induro من إنزيمات النسخ العكسي المشفرة بواسطة الإنترونات من المجموعة الثانية، ويتميز بثبات حراري أعلى، وسرعة معالجة أكبر، وتحمل أفضل لمكونات التفاعل مقارنةً بإنزيمات النسخ العكسي الفيروسية القهقرية. يُستخدم إنزيم النسخ العكسي Induro في تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من النسخ الطويلة، والحمض النووي الريبي (RNA) ذي البنية الثانوية القوية، وعينات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على مثبطات. س: كيف أختار بين إنزيم النسخ العكسي Induro ومنتجات LunaScript وProtoScript المختلفة؟ ج: إنزيم النسخ العكسي Induro هو إنزيم نسخ عكسي مشفر بواسطة الإنترونات من المجموعة الثانية، ويُستخدم في تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من النسخ الطويلة، والحمض النووي الريبي (RNA) ذي البنية الثانوية القوية، وعينات الحمض النووي الريبي (RNA) التي تحتوي على مثبطات. في المقابل، تُعد كواشف LunaScript عبارة عن مزيج رئيسي. مجموعة LunaScript RT Master Mix (خالية من البادئات) (NEB #E3025) مناسبة لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل عام. منتجات LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010/M3010) مُحسّنة لسير عمل RT-qPCR ثنائي الخطوات، حيث لا يتطلب الأمر سوى منتجات cDNA قصيرة. كما تُستخدم LunaScript RT SuperMix في سير عمل تسلسل ARTIC SARS-CoV-2. يوضح هذا الجدول تطبيقات وميزات كل منتج. منتجات النسخ العكسي الفيروسي الرجعي المشفر بالإنترونات: إنزيم النسخ العكسي Induro™ (NEB #M0681)، مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010)، مجموعة LunaScript RT SuperMix (NEB #M3010)، مجموعة LunaScript RT Master Mix (NEB #E3025)، مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560). التطبيقات: تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) الطويل، عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) غير النقية، تطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) (مثل التسلسل المباشر للحمض النووي الريبوزي، وتسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA) طويل القراءة، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA seq)، الكشف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) على مرحلتين، بروتوكول قصير. ✓ خيارات مرنة من البادئات، و dNTPs المعدلة ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ مزيج فائق ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ تتضمن المجموعة جميع المكونات اللازمة. س: هل يمكن استخدام إنزيم النسخ العكسي إندورو في تسلسل الحمض النووي الريبوزي المباشر بتقنية Oxford Nanopore Technologies®؟ ج: نعم، توصي Oxford Nanopore Technologies باستخدام إنزيم النسخ العكسي إندورو لبروتوكولات تسلسل الحمض النووي الريبوزي المباشر (SQK-RNA004). يمكن تنزيل هذه البروتوكولات من صفحات مجتمع ONT (التسجيل مطلوب). س: ما هي درجة حرارة التفاعل المثلى لإنزيم النسخ العكسي إندورو؟ ج: درجة حرارة التفاعل المثلى لإنزيم النسخ العكسي إندورو هي 55 درجة مئوية. بالنسبة للقوالب الصعبة، يمكن زيادة درجة حرارة تخليق الحمض النووي التكميلي إلى 60 درجة مئوية. س: هل من الممكن تعطيل إنزيم النسخ العكسي إندورو؟ ج: إنزيم النسخ العكسي إندورو مقاوم للحرارة، ولكن يمكن تعطيله بسرعة عن طريق حضنه عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بدلاً من ذلك، إذا كانت التطبيقات اللاحقة تتطلب الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبوزي (مثل التسلسل المباشر للحمض النووي الريبوزي)، فيمكن استخدام خطوة تعطيل عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعطيل إندورو عن طريق الهضم بالبروتياز. على سبيل المثال، يمكن إضافة 1 ميكرولتر من بروتياز K المقاوم للحرارة (NEB #P8111) إلى تفاعل الحمض النووي المكمل. بعد حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، يمكن تعطيل بروتياز K المقاوم للحرارة عن طريق حضانة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. س: ما هو وقت الحضانة الموصى به لإنزيم النسخ العكسي إندورو؟ ج: وقت الحضانة الموصى به لإنزيم النسخ العكسي إندورو مدة الحضانة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية. قد يؤدي تمديد فترة الحضانة إلى 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية إلى تحسين إنتاجية منتجات cDNA الطويلة. س: ما هو أطول cDNA تم إنتاجه بواسطة إنزيم النسخ العكسي إندورو؟ ج: أطول cDNA تم إنتاجه يزيد عن 20 كيلوبايت بناءً على بيانات التسلسل المباشر لـ cDNA. س: ما هي كمية إنزيم النسخ العكسي إندورو التي يجب استخدامها في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر؟ هل يمكن تحسين الإنتاجية باستخدام كمية أكبر من الإنزيم؟ ج: بشكل عام، يكفي 1 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي إندورو (200 وحدة) في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر. يمكن زيادة إنتاجية بعض منتجات cDNA بمضاعفة كمية الإنزيم (400 وحدة). س: ما هي عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المتوافقة مع إنزيم النسخ العكسي إندورو؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخلاص أو تنقية مادة RNA الأولية. ومع ذلك، فإن إنزيم النسخ العكسي إندورو يحافظ إنزيم النسخ العكسي على أدائه القوي في وجود العديد من المثبطات. نوصي بإجراء تجربة أولية للعينة/التحليل المحدد. قد يؤدي رفع تركيز كلوريد المغنيسيوم النهائي (NEB #B9021) حتى 3 ملي مولار عند التركيز 1X إلى تحسين تحمل المثبطات. س: ما كمية قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يجب استخدامها؟ ج: يمكن أن تكون قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) هي الحمض النووي الريبوزي الكلي، أو الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، أو الحمض النووي الريبوزي المُصنّع عن طريق النسخ في المختبر. كقاعدة عامة، يمكن استخدام ما يصل إلى 1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر. س: ما البادئ الذي يجب استخدامه مع إنزيم النسخ العكسي إندورو؟ هل يمكنني إضافة بوادئ خاصة بجين معين إلى تفاعل الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذي ذيل متعدد الأدينين (poly(A))، يُوصى باستخدام أوليغو d(T)23 VN (NEB #S1327). إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام أوليغو dT أطول. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام بادئ خاص بجين معين. يُستخدم في تفاعل الحمض النووي المكمل (cDNA) بدلاً من أوليغونوكليوتيد بولي (dT). بالنسبة لقوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي لا تحتوي على ذيل بولي (A)، يمكن استخدام بادئات عشوائية أو بادئات خاصة بالجين لتخليق الحمض النووي المكمل. قد تؤدي إضافة بادئ خاص بالجين إلى تفاعل الحمض النووي المكمل إلى زيادة طفيفة في كمية الحمض النووي المكمل للهدف المحدد. لقد اختبرنا تراكيز نهائية قدرها 0.1 ميكرومولار، و0.5 ميكرومولار، و1 ميكرومولار من البادئات الخاصة بالجين، وحققنا أداءً جيدًا عند جميع التراكيز، ولكننا نقترح 0.5 ميكرومولار كنقطة بداية مع تعديل التركيز وفقًا لذلك. س: ما هي أفضل التطبيقات لإنزيم النسخ العكسي إندورو؟ ج: يتميز إنزيم النسخ العكسي إندورو بثبات حراري عالٍ، وقدرة على المعالجة، وتحمل للمثبطات. قد يتفوق إندورو على إنزيمات النسخ العكسي الأخرى في المجالات التالية: تخليق الحمض النووي المكمل الصعب من الحمض النووي الريبوزي ذي البنى الثانوية القوية، أو النسخ الطويلة، أو العينات غير النقية؛ سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبوزي المباشر على تقنيات أوكسفورد نانوبور. منصة تسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA) طويل القراءة. تطبيقات تستخدم فيها إنزيمات النسخ العكسي المشفرة بالإنترونات. س: هل يمكن استخدام منتجات الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتجة عن إنزيم النسخ العكسي Induro في تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)؟ ج: تم تحسين LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010/M3010) لسير عمل RT-qPCR ثنائي الخطوات، ويُوصى باستخدامه بدلاً من إنزيم النسخ العكسي Induro لهذا التطبيق تحديدًا. س: ما هو بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة الذي يمكن استخدامه لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بعد تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ ج: لتفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق، نوصي باستخدام OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 أو M0485) للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) حتى 5 كيلوبايت، أو Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) للحصول على أعلى دقة، أو LongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) للحصول على إنتاجية عالية من منتجات أطول. س: لماذا لدي هل تعاني من انخفاض إنتاجية الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: هناك عدة أسباب لانخفاض إنتاجية الحمض النووي المكمل. إليك بعض الاقتراحات لتحسينها: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز المُشوه أو جهاز BioAnalyzer (Agilent). يُعدّ الحمض النووي الريبوزي السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي المكمل كامل الطول. يجب أن يكون للحمض النووي الريبوزي نسبة امتصاص ضوئي لا تقل عن 1.7 عند 260 نانومتر إلى 280 نانومتر، أو رقم RIN أكبر من 8. يمكن إزالة الملوثات مثل EDTA والجوانيدينيوم عن طريق الترسيب بالإيثانول متبوعًا بغسل بالإيثانول بنسبة 70%. كما يمكن إزالة السكريات المتعددة عن طريق الترسيب بكلوريد الليثيوم. يمكن إزالة البروتينات الملوثة، مثل البروتيازات، عن طريق خطوة تنقية الحمض النووي الريبوزي باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي الريبوزي أو الاستخلاص بالفينول/الكلوروفورم. زد كمية الحمض النووي الريبوزي المستخدم، خاصةً للحمض النووي الريبوزي منخفض الوفرة. س: هل يجب عليّ تضمين تفاعل تحكم بدون إنزيم النسخ العكسي (No-RT) باستخدام إنزيم Induro® RT لتخليق الحمض النووي المكمل؟ ج: نعم. وجود بقايا من الحمض النووي الريبوزي المكمل (cDNA) قد تتداخل كمية الحمض النووي الجينومي أو نواتج التفاعل المتبقية مع عملية الكشف اللاحقة. لذلك، من المهم إجراء تفاعلات التحكم المناسبة (No-RT) لمراعاة هذه التأثيرات. ستساعد معالجة عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام إنزيم DNaseI (NEB #M0303) على إزالة الحمض النووي الملوث قبل إجراء عملية تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA). س: كيف أعرف ما إذا كان قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الخاص بي ذو جودة جيدة؟ ج: يُعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. تشير نسبة الامتصاص عند A260/A280 التي تزيد عن 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8 على جهاز BioAnalyzer عادةً إلى جودة عالية للحمض النووي الريبوزي (RNA). س: هل يمكنني تخزين إنزيم النسخ العكسي Induro ومحلول التفاعل الخاص به عند 4 درجات مئوية؟ ج: للتخزين قصير المدى، يمكن حفظ الإنزيم عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد، ويمكن تخزين محلول التفاعل Induro 5X عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. للتخزين طويل المدى، يُوصى بتخزين الإنزيم ومحلول التفاعل عند -20 درجة مئوية. س: هل يمكنني إجراء تفاعل تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) في درجة حرارة الغرفة عند استخدام إنزيم النسخ العكسي إندورو؟ ج: نعم. يمكن إجراء تفاعلات تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي إندورو في درجة حرارة الغرفة.