نيو إنجلاند بيولابس، M0689S، أوتنتيكيز®

مزيج من النيوكليازات المتخصصة بالبنية، القادرة على التعرف على عدم التطابق الخارجي والحذف والإدخال وقطعها. الفئات ذات الصلة: التحقق من صحة تحرير الجينات القائم على تقنية كريسبر، وإنزيمات إصلاح الحمض النووي، والنيوكليازات الداخلية المتخصصة بالبنية. مواصفات ظروف التفاعل: محلول تفاعل Authenticase® بتركيز 1X، يُحضن عند 42 درجة مئوية. محلول تفاعل Authenticase® بتركيز 1X: 10 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 8 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 500 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار دايثيوثريتول، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: لا. الأسئلة الشائعة : س: ما هي ظروف التفاعل المستخدمة لتحديد Authenticase®؟ ج: يُعرَّف التفاعل بأنه إضافة 1 ميكرولتر من إنزيم Authenticase إلى حجم تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على محلول تفاعل Authenticase بتركيز 1X، ومزيج من 0.33 بيكومول من جزيء DNA مزدوج السلسلة مكون من 60 قاعدة، يحتوي على عدم تطابق A/C وT/G، بالإضافة إلى عدم تطابق إدخال/حذف (indel) بطول 2 زوج قاعدي. بعد التحضين عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تم هضم أكثر من 90% من DNA الركيزة، كما تم تحديده باستخدام هلام الأغاروز E-gel بتركيز 4%. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل حول بروتوكول Authenticase وطريقة استخدامه في دليل المنتج. س: كيف يُحسِّن Authenticase® جودة ودقة تجميع جينات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: Authenticase هو مزيج خاص من النيوكليازات المتخصصة في بنية الحمض النووي، والقادرة على التعرف على مناطق عدم التطابق ومناطق الإدخال/الحذف (indel) الخارجية وقطعها، والتي يتراوح طولها من 1 إلى 10 أزواج قاعدية (bp) على DNA مزدوج السلسلة. من خلال إزالة "الأخطاء" إنزيميًا قبل خطوة إعادة التموضع والتضخيم النهائية، يُمكن لـ Authenticase تقليل الأخطاء في تجميع جينات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) القائم على الأوليغونوكليوتيدات. س: كيف يُمكنني تحويل الجين الذي أرغب في دراسته إلى أوليغونوكليوتيدات؟ ج: على الرغم من أن NEB® لا تُوفر أداة ويب لتصميم الأوليغونوكليوتيدات لتخليق الجينات، إلا أن هناك العديد من الحلول المُتاحة من جهات خارجية. على سبيل المثال، يُؤتمت DNAWorks (https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/) تصميم الأوليغونوكليوتيدات لتخليق الجينات باستخدام طرق PCR. س: لماذا تُوصون بإعداد أنبوبين لتفاعل PCR يحتويان على كميات مُختلفة من العينات المُعالجة بـ Authenticase® كقوالب؟ ج: غالبًا ما تُركز عمليات تخليق الجينات التي تُنفذها بنفسك على إثراء الجين المستهدف كامل الطول قبل تجميع الحمض النووي أو استنساخه في ناقل الحفظ. نحن لا نُلزم المستخدم بإعداد تفاعلات إثراء مُتعددة. مع ذلك، بما أن التضخيم بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قد ينتج كميات متفاوتة من الهدف كامل الطول، نقترح إجراء أكثر من تفاعل PCR واحد لضمان توليد كمية كافية من الهدف كامل الطول. بعد تفاعل PCR، اختر الناتج الأكثر نقاءً عن طريق إجراء تحليل هلام الأغاروز أو جهاز Bioanalyzer قبل استنساخ القطعة. س: هل يمكنني استخدام Authenticase® لتطبيقات تحرير الجينوم؟ ج: نعم. يمكن استخدام Authenticase® للكشف عن عدم التطابق/تكوين الإدخالات/الحذوفات (أحداث التحرير على الهدف) في عمليات تحرير الجينوم. صُمم هذا المنتج لقطع عدم التطابق بكفاءة في الحمض النووي الهجين، ويتفوق على فحص T7 Endo I التقليدي عبر نطاق واسع من نسب الطفرة/النمط البري. يُرجى الاطلاع على اختبار الكشف عن عدم التطابق (NEB #M0689). س: هل يتعرف Authenticase® على عدم تطابق زوج القاعدة المفرد أو الإدخالات/الحذوفات؟ ج: الإجابة معقدة. توجد ثمانية أنواع من عدم تطابق القواعد المفردة: C/C، T/C، A/C، T/G، A/G، G/G، T/T، وA/A. يستطيع إنزيم Authenticase التعرف على سبعة من هذه الأنواع الثمانية، باستثناء عدم تطابق A/G. يُعدّ قطع هذه الأنواع باستخدام Authenticase أكثر كفاءة من استخدام إنزيم T7 Endonuclease I، الذي يتميز بنشاط محدود تجاه هذه الأنواع من عدم تطابق القواعد المفردة (Biochemistry 2004, 43, 4313-4322). لا يواجه كلا الإنزيمين أي مشكلة في قطع الحمض النووي الهجين (heteroduplex DNA) الذي يحتوي على حذف أو إدخال يتراوح بين 1 و10 أزواج قاعدية، أو عدم تطابق يتراوح بين 2 و10 أزواج قاعدية. س: ما هي الإضافات الشائعة التي تثبط عمل إنزيم Authenticase®؟ ج: يعمل عامل الاستخلاب، مثل EDTA، على تثبيط التفاعل. يُرجى ملاحظة أن إنزيم Authenticase يتطلب أيونات المغنيسيوم (Mg2+)، الموجودة في محلول التفاعل. س: ما هي كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الموصى بها لتضخيم الحمض النووي في فحوصات الكشف عن عدم تطابق الحمض النووي في تقنيات تحرير الجينوم (CRISPR/Cas9، TALEN، ZFN)؟ ج: توصي شركة NEB باستخدام مزيج Q5® Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (NEB #M0494). توفر بوليميرازات الحمض النووي Q5 دقة عالية وموثوقية فائقة. بالنسبة لبعض المناطق ذات التكرار العالي، أثبت بوليميراز الحمض النووي LongAmp® Taq (NEB #M0323) فعاليته. س: هل يمكنني استخدام فحوصات الكشف عن عدم تطابق الحمض النووي في تقنيات تحرير الجينوم Authenticase® (CRISPR/Cas9، TALEN، ZFN) مع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المنقاة؟ ج: نعم. لتحليل سريع، نوصي باستخدام 6 ميكرولتر من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) المناسب مباشرةً في تفاعل Authenticase بحجم 20 ميكرولتر عند استخدام كواشف PCR التالية: Q5® Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (NEB #M0494) أو OneTaq DNA Polymerase (NEB #M0480). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام 1-12 ميكرولتر من الحمض النووي المعالج بواسطة Exo-CIP™ Rapid PCR Cleanup Kit (NEB #E1050) مباشرةً في تفاعل Authenticase بحجم 20 ميكرولتر عند استخدام كواشف PCR التالية: Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB #M0491) مع محلول التفاعل Q5 (حتى 6 ميكرولتر) أو محلول تفاعل OneTaq DNA Polymerase (حتى 12 ميكرولتر). للمزيد من التفاصيل، يُرجى مراجعة دليل المنتج. لتقدير أكثر دقة لكفاءة التحرير الجيني، يُوصى باستخدام مُضخّمات مُنقّاة من مجموعة Monarch® PCR & DNA Cleanup (NEB #T1030). س: ما هو حجم مُضخّم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الذي يجب تصميمه لتحليل كفاءة التحرير الجيني؟ ج: إذا كان سيتم استخدام جهاز Bioanalyzer لتحليل كفاءة التحرير الجيني، توصي NEB بتصميم منتجات PCR بحجم 700 زوج قاعدي تقريبًا، مع أحجام مُتوقعة للمنتجات المقطوعة تتراوح بين 450 و250 زوج قاعدي تقريبًا. س: إذا كان ناتج تفاعل PCR منخفضًا، فهل يُمكنني إضافة أكثر من 5 ميكرولتر من ناتج التفاعل إلى تفاعل الهضم؟ ج: تم تحسين عملية الهضم للاستخدام مع ما يصل إلى 5 ميكرولتر من ناتج تفاعل PCR غير المُنقّى. قد تُؤدي إضافة أكثر من 5 ميكرولتر من ناتج التفاعل إلى التداخل مع تفاعل الهضم باستخدام إنزيم Authenticase. نوصي بتحسين تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للحصول على مردود أعلى، أو تركيز ناتج التفاعل باستخدام أعمدة التنقية بواسطة مجموعة NEB Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (5 ميكروغرام) (NEB #T1030). س: لماذا أرى حزمة إضافية عند تشغيل الحمض النووي الهجين غير المهضوم على جهاز Bioanalyzer أو هلام الأغاروز؟ ج: في بعض الحالات، يتحرك الحمض النووي الهجين غير المهضوم ببطء طفيف مقارنةً بالحمض النووي المتماثل. اعتمادًا على تركيب الطفرات، قد يظهر هذا أحيانًا كحزمة أعلى الحمض النووي المتماثل على هلام الأغاروز. س: ما الفرق بين إنزيم Mismatch Endonuclease I (NEB #M0678) وإنزيم Authenticase (NEB #M0689)؟ ج: إنزيم Mismatch Endonuclease I يقطع فقط عدم تطابق قواعد الحمض النووي التالية: G/G وG/T وT/T. سيقوم برنامج Authenticase بفصل جميع حالات عدم تطابق القاعدة المفردة (باستثناء G/A) وجميع حالات عدم تطابق الحمض النووي التي تتكون من 2+ زوج من القواعد وعمليات الإدخال والحذف (الإدخال و/أو الحذف).