نيو إنجلاند بيولابس، M0764S، نيوكلياز NEBExpress® النشط بالملح

الفئات ذات الصلة: أدوات البروتين، الإكسونوكليازات والإندونوكليازات غير النوعية. التطبيقات: تنقية البروتين، أدوات تحليل البروتين، مواصفات التعبير البروتيني. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحرير 32 بيكومول من FAM من أوليغونوكليوتيد دبوس الشعر الموسوم بـ FAM-BHQ1 في دقيقة واحدة عند 25 درجة مئوية في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر في محلول مكون من 25 ملي مولار Tris-HCl، و500 ملي مولار NaCl، و5 ملي مولار MgCl2، و0.005% Tween 20 (الأس الهيدروجيني 8.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 25 ملي مولار Tris-HCl، 500 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار MgCl2، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: ما هي فوائد العمل في محلول ملحي عالي التركيز؟ ج: إجراء عملية تنقية في محلول ملحي عالي التركيز (≥ 200 ملي مولار من كلوريد الصوديوم) يسمح بفصل الشوائب (الأحماض النووية) عن البروتينات أو الفيروسات عن طريق تعطيل التفاعلات الكهروستاتيكية بين هذه الجزيئات. كما يمكن للمحلول الملحي عالي التركيز تحسين ذوبان البروتين عندما يكون التكتل ناتجًا عن التفاعلات الكهروستاتيكية. لهذه الأسباب، تتطلب العديد من طرق المعالجة الحيوية استخدام محلول ملحي عالي التركيز. يمكن استخدام إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease مباشرةً في هذه الظروف للتخفيف من تحديات اللزوجة العالية، وتقليل الضغط العكسي، و/أو إزالة الأحماض النووية. س: هل يتمتع إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease بنفس كفاءة إنزيم Serratia marcescens nuclease؟ ج: لا. إن إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease أكثر نشاطًا (حوالي 4 أضعاف، عند معايرة التركيز نفسه) من إنزيم Serratia marcescens nuclease على الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA عند استخدامه في محلول منظم يحتوي على ≥ 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم/كلوريد البوتاسيوم. س: كيف تتم مقارنة تعريف وحدة NEBExpress® Salt Active Nuclease مع تعريف وحدات النيوكليازات الأخرى المماثلة التي تعمل بالملح؟ ج: على الرغم من اختلاف ظروف اختبار تعريف وحدة NEBExpress Salt Active Nuclease (درجة الحرارة، الركيزة، والمحلول المنظم) عن النيوكليازات الأخرى المماثلة المتوفرة في السوق، إلا أننا نقدر أن NEBExpress Salt Active Nuclease أكثر نشاطًا بمرتين تقريبًا مقارنةً بالنيوكليازات الأخرى التي تعمل بالملح. وللتحويل من نيوكلياز آخر يعمل بالملح إلى NEBExpress Salt Active Nuclease، نوصي بإجراء اختبار استبدال بنسبة 1:1 بناءً على الوحدات. س: هل يمكنني استخدام NEBExpress® Salt Active Nuclease في محلول منظم منخفض الملوحة؟ ج: نعم. يحتفظ NEBExpress Salt Active Nuclease بنسبة 60% من نشاطه عند تركيز 250 ملي مولار من كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم، وبنسبة 15% في غياب الملح. اعتمادًا على التطبيق (تقليل اللزوجة، التحلل الجزئي أو الكامل للأحماض النووية)، قد يلزم زيادة تركيز الإنزيم ووقت الحضانة عند استخدام محلول منظم منخفض الملوحة. س: هل إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease متوافق مع أعمدة التقارب مثل IMAC؟ ج: إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease غير موسوم، ويمكن استخدامه لتنقية البروتينات الموسومة، مثل البروتين الموسوم بالهيستيدين، باستخدام IMAC. س: هل يمكنني إزالة إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease من العينة؟ ج: نعم. يرتبط إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease بقوة بعمود التبادل الكاتيوني نظرًا لارتفاع نقطة التعادل الكهربائي (pI) الخاص به، وبالتالي، يمكن إزالته بسهولة عن طريق التقاطه على راتنج التبادل الكاتيوني (يوصى باستخدام راتنجات Source 30S، أو SP HP، أو POROS 50HS). س: كيف يمكنني تعطيل إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease بعد الاستخدام؟ ج: يمكن تعطيل إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease بإحدى الطرق التالية: التعطيل الحراري: حضن العينة عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين، أو عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة، أو عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. التثبيط الكيميائي: أضف أكثر من 10 ملي مولار من EDTA، أو 0.5% من SDS، أو أكثر من 20 ملي مولار من TCEP. التثبيط الكيميائي والحراري: أضف 1 ملي مولار من DTT واحضن عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. التحلل الأنزيمي: أضف بروتينيز K (NEB #P8107S) أو بروتينيز K غير المستقر حراريًا (NEB #P8111S). س: ما الفرق بين NEBExpress® Salt Active Nuclease وDNase I-XT (NEB #M0570)؟ ج: يقوم NEBExpress Salt Active Nuclease بتحليل الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA، بينما يقوم DNase I-XT بتحليل الحمض النووي DNA فقط. وهو نشط بين تركيز ملحي من 0 إلى 1000 ملي مولار (التركيز الأمثل عند 500 ملي مولار)، بينما تم تصميم DNase-I XT ليكون نشطًا بين تركيز ملحي من 0 إلى 300 ملي مولار. علاوة على ذلك، يمكن إزالة إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease بسهولة في عمود واحد نظرًا لارتباطه الفعال جدًا براتنج التبادل الكاتيوني. س: ما هو متوسط ​​تركيز البروتين لإنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease في كل أنبوب؟ ج: قد يختلف تركيز البروتين لإنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease من دفعة إلى أخرى، ولكنه يبلغ حوالي 0.1 ملغم/مل. س: ما هو الوزن الجزيئي لإنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease؟ ج: يبلغ الوزن الجزيئي لإنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease حوالي 25 كيلو دالتون. س: هل إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease مُغلْيكوزيل؟ ج: لا. يُنتَج إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease من بكتيريا الإشريكية القولونية، وبالتالي فهو غير مُغلْيكوزيل، ويظهر على شكل حزمة واحدة عند حوالي 25 كيلو دالتون على هلام البروتين. س: أرى أن شركة NEB تُقدِّم إصدارين من إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease. ما الفرق بين إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease (NEB #M0764) وإنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease، المُصنّف وفقًا لمعايير التصنيع الجيد (NEB #G8024)؟ ج: يُصنّع إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease، المُصنّف وفقًا لمعايير التصنيع الجيد (GMP) الخاصة بشركة New England Biolabs*، وذلك لتلبية متطلبات توثيق الجودة الصارمة واحتياجات التصنيع، ويتضمن اختبارات إضافية مثل اختبار السموم الداخلية واختبار الحمل الميكروبي. كلا الإنزيمين متطابقان من الناحية الإنزيمية ومُصاغان في نفس المحلول المنظم. مع ذلك، يُقدّم إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease، المُصنّف وفقًا لمعايير التصنيع الجيد (NEB #G8024) بتركيز أعلى بعشرة أضعاف، أي 1,000,000 وحدة/مل (1 ملغم/مل)، لتقليل تخفيف مزرعة الخلايا/العينة مقارنةً بإنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease (NEB #M0764) المُقدّم بتركيز 100,000 وحدة/مل.