نيو إنجلاند بيولابس، M0766S، ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG)

الفئات ذات الصلة: إنزيمات إصلاح الحمض النووي وإنزيمات النوكلياز الداخلية المتخصصة بالبنية. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإنشاء موقع AP من 1 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 60 قاعدة، يحتوي على زوج غير متطابق T:G واحد ضمن سياق CpG*، في تفاعل إجمالي حجمه 20 ميكرولتر خلال ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. *يُحضَّر الزوج غير المتطابق AT:G بوضع قاعدة T في الموضع 24 من جزيء ssDNA مكون من 60 قاعدة، مُوسَم بـ FAM عند الطرف 5′، وقاعدة G في الموضع 25 من جزيء مكمل غير مُوسَم، ثم يتم تهجينهما لتكوين ركيزة مزدوجة. شروط التفاعل: محلول تفاعل TDG بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل TDG بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 0.25 ملي مولار TCEP، 10 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 500 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الأسئلة الشائعة : س: هل إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) (NEB #M0766) بروتين مُوسَم؟ ج: يحتوي TDG على وسم هيستيدين في الطرف الكربوكسيلي. س: ما هو نشاط إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) (NEB #M0766) في محاليل NEBuffer المختلفة؟ ج: يبلغ نشاط إنزيم TDG 50% في محلول NEBuffer r1.1، و0% في محلول NEBuffer r2.1، و0% في محلول NEBuffer r3.1، و20% في محلول rCutSmart™. مع ذلك، عند إضافة 1 ملي مولار من TCEP أو DTT طازجة إلى كل من هذه المحاليل في التفاعل، يعود نشاط إنزيم TDG إلى 100%. س: هل يُثبَّط إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) (NEB #M0766) بالملح؟ ج: يصبح أداء إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) دون المستوى الأمثل عندما تصل تركيزات الملح إلى 200 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. س: لا أرغب في استخدام محلول التفاعل المرفق لإنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) في تجربتي. هل لديكم أي اقتراحات لتحسين ظروف المحلول؟ ج: يعمل إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (NEB #M0766) بأفضل كفاءة في وجود عامل مُختزل، لذا فإن إضافة 1 ملي مول من DTT أو TCEP الطازج ستُحسّن الأداء بشكل كبير. في وجود عامل مُختزل طازج، يتحمل نشاط TDG تركيزًا يصل إلى 200 ملي مول من كلوريد الصوديوم قبل أن يتأثر. س: هل يمكن تعطيل إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) (NEB #M0766) بالحرارة؟ ج: نعم. يمكن تعطيل TDG بالحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. س: ما هي القواعد التي يتعرف عليها إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) (NEB #M0766) ويزيلها؟ أ: الركائز الرئيسية لإنزيم TDG هي dU أو dT غير المتطابقة مع dG في الحمض النووي المزدوج، مع تفضيل سياق CpG (1). بالإضافة إلى ذلك، أُفيد أن إنزيم TDG يتمتع بتسامح واسع مع الركائز، بما في ذلك نشاطه على 5-فورميل سيتوزين و5-كربوكسي سيتوزين (نواتج أكسدة 5mC) (2)، و5-هيدروكسي ميثيل يوراسيل (3)، و3،N4-إيثينوسيتوزين (4)، و5-فلورويوراسيل (5)، ومشتقات معدلة أخرى (6). المراجع: 1. Waters, TR and Swann, PF (1998). J Biol Chem. 273, 2007-14. 2. He YF et al. Science. (2011). 333, 1303-07. 3. Baker D. et al. (2002) Chem Res Toxicol. 15, 33-9. ٤. سابارباييف، م. ولافال، ج. (١٩٩٨). وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم. ٩٥، ٨٥٠٨-١٣. ٥. هارديلاند، يو. وآخرون. (٢٠٠٠). مجلة الكيمياء البيولوجية. ٢٧٥، ٣٣٤٤٩-٣٣٤٥٦. ٦. بينيت إم تي وآخرون. (٢٠٠٦). مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية. ١٢٨(٣٨)، ١٢٥١٠-٩. س: ما الركيزة المستخدمة لاختبار إنزيم ثايمين-دي إن إيه جليكوزيلاز (TDG) (NEB #M0766)؟ ج: الركائز المستخدمة لاختبار نشاط الإنزيم مدرجة ضمن تعريف الوحدة لكل إنزيم. يُختبر إنزيم TDG باستخدام ركيزة دي إن إيه مزدوجة السلسلة مكونة من ٦٠ قاعدة، تحتوي على عدم تطابق T:G في موقع مركزي ضمن سياق CpG.